서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식
Summary
Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.
Abstract
복잡한 번역 후 수정 재조합 단백질을 생산하는 기술은 구조와 기능 연구를위한 주요 과제를 나타냅니다. 일시적으로 형질 감염된 포유 동물 세포주로부터 신속한 확립하고 높은 회복 자연스럽게 ER 및 골지체 매개 분비 경로를 통해 표출되는 단백질을 발현하는 효과적인 수단이 장벽을 해결하고있다. 여기서 인간 HEK293F 및 높은 단백질 수율을 위해 설계 포유 동물 발현 벡터로 형질 감염된 HEK293S 세포 라인을 사용하여 단백질 발현을위한 하나의 프로토콜이다. 이 시스템의 적용은 문화의 리터 당 회수 정제 단백질의 95-120 mg의 사이의 수익률로 표현 세 대표하는 당 단백질을 사용하여 설명된다. 이들 단백질은 인간과 쥐 FcγRIIIa α2-6 시알 산 전이 효소, ST6GalI 모두 N 말단 GFP 융합으로 표현뿐만 아니라 변형되지 않은 인간 면역 글로불린 G1 된 Fc이다. 이 강력한 시스템 요로 감염동위 원소 적으로 농축 된 단백질 및 질량 분광법 및 핵 자기 공명 분광법을 이용한 구조 연구 탄수화물의 발현에 적응할 혈청 배지를 활용합니다. 또한, N 글리 칸의 조성물은 수율을 감소시키지 않는 방식으로 특정 당쇄 변형을 방지하는 작은 분자를 첨가함으로써 조절 될 수있다.
Introduction
구조와 기능에 대한 자세한 분석을 위해 적절하게 접혀 및 번역 후 변형 된 인간 단백질의 높은 수율을 생산하는 것은 중요한 과제로 남아. 발현 시스템의 많은 수의 네이티브와 같은 기능과 행동 재조합 단백질을 생산하는 사용할 수 있습니다. 효모, 식물, 곤충 및 포유 동물 시스템은도 1 ~ 4를 설명하지만 세균 발현 시스템, 주로 대장균 균주 인해 이들 발현 시스템의 단순성, 연구 분야에 가장 접근하고 일반적으로 사용되는 도구를 나타낸다. 그러나, 이들 시스템들의 대부분은 표적 단백질의 적절한 번역 후 변형 불가능하다. 바브와 Moremen 실험실의 근본적인 관심은 적절한 당질과 진핵 생물의 단백질을 생산하고있다. 대부분의 인간 단백질 (5) 적절한 기능에 적합한 글리코 실화를 필요로한다.
진핵글리코 실화가 광범위한 기계 모두 아스파라긴 (N)를 포함 변형의 다양한 범위를 제조 할 수있다 – 세린 / 트레오닌 (O)는 복합 글리 칸 6 -linked. 이것은 인간 단백질의> 50 % 7 N 글리코 실화가있는 것으로 추정된다. 글리 칸은 몇 가지 이름 인자 IX 같은 치료 단일 클론 항체, 에리트로 포이 에틴, 혈액 응고 인자 등 많은 단백질의 필수 구성 요소입니다. 여러 방법이 적절 N-당화 단백질을 준비하기 위해 존재하고 8-10 순수 합성에 이르기까지 다양하지만, 가장 강력한를 할 놀랍게도, 인간의 발현 시스템은 지금까지 입증되지 설계 재조합 시스템 15-20에서 11-14 또는 복구를 화학 효소합니다 인간 단백질을 생성하기위한 방법.
많은 인간 치료 용 당 단백질은 포유 동물 세포를 사용하여 재조합 시스템에서 생산된다. 주 시스템 중국 햄스터 난소 (CHO), 마우스 골수종 (NS0), 아기 햄스터 Kidne이다Y (BHK), 인간 배아 신장 (HEK-293) 및 단백질 생산 4,21,22에 대한 접착 또는 현탁 배양에 사용되는 인간의 망막 세포 라인. 그러나, 포유 동물 단백질의 발현 시스템은 안정 세포주 고가 성장 배지 및 형질 보조 기판 (23)의 시저 발생을 요구했다.
포유 동물 세포의 형질 감염은 칼슘 포스페이트 (24, 25), 양이온 성 중합체 (DEAE 덱스 트란, 폴리 브렌, 폴리 리신, 폴리 에틸 이민 (PEI)) 또는 양으로 하전 된 양이온 성 리포좀을 포함하여 다수의 제 26 ~ 29의 도움으로 달성된다. PEI는 다양 이온, 대전, 또는 선형 DNA와 안정한 복합체를 형성하고있다 endocytosed 분기 고분자 (25 kDa의) (26)이다. 엔도 좀의 산성화되면, PEI는 세포질 26,30에 엔도 좀과 DNA의 릴리스의 파열로 이어지는, 팽창 생각된다.
suspensi에서 최근까지, 일시적 형질배양에서 세포 배양 물 (29)을 첨가하여 종래 DNA / PEI 복합체 형성에 의해 실시 하였다. 그러나 WURM 및 동료 31,32 동일계에서 DNA / PEI 복합체를 형성 HEK293 세포에서 재조합 단백질 생산을 위해 최적화 고효율 프로토콜을보고했다. 이 배지 내로 제제 복합체의 살균 및 버퍼 교환을 피했다. 상당한 수율 증가 (33)을 주도 식 향상 플라스미드를 포함하여 더 최적화. 여기에서 이러한 발전에 구축하고 광범위하게 적용하는 방법이다. 발현 조건도 글리 칸 N 조성에 영향을 위해 변경 될 수있다.
중간 단계에서 N 글리 칸 처리를 정지 유전자 결실 감염된 HEK293S 세포 라인은, (GlcNAc의 2 사람 5) 34 (2) N- 아세틸 글루코사민 잔기 플러스 다섯 만노스 잔기로 이루어진 균일 한 N 글리 칸으로 단백질의 발현에 이르게 (35). 이 세포N-acetylglucosaminyl 트랜스퍼 I (GntI) 하류 N-글리 칸 처리 (36, 37)에 필요한 유전자가 부족합니다. kifunensine, 시알 산 유사체와 푸 코스 아날로그 및 2- 데 옥시 -2- 플루오로 – 퓨 코스를 포함하여 당 전이 효소 억제제의 사용은 유사한 효과 및 N- 글리 칸 38-41 처리 한계를 가진다.
프로토콜은 여기에보고 한도 42,43에 도시 된 바와 같이 pGEn2 벡터를 사용하여, PEI를 이용한 일시적인 포유류 세포 선 (또는 HEK293F 감염된 HEK293S 세포)에 형질 감염하고, 적절히 글리코 실화 된 단백질의 높은 수율의 복구. 이 시스템은 강건하고, 재조합 단백질의 큰 역가의 제조 동위 원소 표지 및 당쇄 공학을 포함하는 다양한 요인을 수용 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 S 또는 HEK293F 세포의 일시적인 형질 감염을 통해 단백질 발현을 도시한다. 바브와 Moremen 실험실 설립 형질 최적 조건은 고효율 형질 감염을 달성 셀 밀도 및 시약 농도의 중요한 조합을 채용한다. 이 프로토콜을 구현하는 중요한 고려 사항은 다음과 같습니다 (일관된 문화는 시간을 두 배로 포함) 형질 전환 이전에 안정적인 문화를 유지하는 단계; 95 % 이상 세포 생존 능력 (1 × 106…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 재정적 보조금 K22AI099165 (AWB)에 의해, P41GM103390 (KWM)와 국립 보건원에서 P01GM107012 (KWM), 아이오와 주립 대학에서 생화학, 생물 물리학 및 분자 생물학의 로이 J. 카버 부서에서 기금에 의해 지원되었다 . 이 작품의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Biosafety cabinet | NuAire, Inc. | CellGard ES NU-S475-400 | Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Incubation shaker | INFORS HT | Multitron Cell | |
| Medium A: FreeStyle Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | |
| Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium | SIGMA | 14571C | |
| 125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431143 | |
| 250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning Incorporated/Life Sciences | 431144 | |
| FreeStyle HEK 293F Cells | Life Technologies | R790-07 | |
| 1 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10B | |
| 10 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10J | |
| 25 ml Disposable serological pipette | Fisher Scietific | 13-676-10K | |
| Pipettor (Pipet-Aid XP) | Drummond Scientific | 161263 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 23966 | Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C. |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
| 25 mm Syringe Filter, 0.22 μM | Fisher Scietific | 09-719A | |
| Trisaminomethane (Tris base) | Fisher Scietific | BP152-1 | |
| XL1-Blue | Stratagene | 222249 | |
| Trypton | Fisher Scietific | BP1421-2 | |
| Yeast extract | Fluka Analytical | 92144 | |
| Sodium chloride | BDH chemicals | BDH8014 | |
| Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12145 | |
| Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | Prepare stock solution of 220 mM in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C |
| Corning 250 mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated/Life Sciences | 430776 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | EW-17707-65 | |
| Protein A-Sepharose column | SIGMA | P9424 | |
| Ni-NTA superflow | QIAGEN | 30430 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scietific | BP308-500 | |
| Glycine | Fisher Scietific | BP381-500 | |
| 10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC901096 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ALDRICH | L3771 | |
| Beta-mercaptoethanol | ALDRICH | M6250 | |
| Glycerol | SIGMA | G5516 | |
| Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scietific | 64-19-7 | |
| coomassie brilliant blue | Bio-Rad | 161-0406 | |
| MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO | Applied Biosystems | ||
| 15N labeled L-Tyrosine | ALDRICH | 332151 | |
| 15N labeled L-Lysine | ALDRICH | 592900 | |
| Unlabeled L-Phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
| 13C6-Glucose | ALDRICH | 389374 | |
| 2-deoxy-2-fluoro-l-fucose | SANTA CRUZ Biotechnology | sc-283123 |
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