Summary

High Yield Expression av rekombinant humant Proteiner med Transient Transfeksjon av HEK293 Celler i Suspension

Published: December 28, 2015
doi:

Summary

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Abstract

Kunsten å produsere rekombinante proteiner med komplekse post-translasjonelle modifikasjoner er en stor utfordring for studier av struktur og funksjon. Den raske etableringen og høy utvinning fra forbigående-transfekterte pattedyrcellelinjer løser denne barrieren, og er et effektivt middel for å uttrykke proteiner som er naturlig kanaliseres gjennom ER og Golgi-mediert sekresjonsveien. Her er en protokoll for protein uttrykk ved hjelp av menneskelig HEK293F og HEK293S cellelinjer transfektert med en pattedyrekspresjonsvektor designet for høye proteinutbytter. Anvendeligheten av dette systemet er vist ved bruk av tre representative glykoproteiner som uttrykt med utbytter mellom 95 til 120 mg av renset protein utvunnet pr liter kultur. Disse proteinene er den humane FcγRIIIa og rotte α2-6 sialyltransferase, ST6GalI, begge uttrykt med et N-terminalt fusjons GFP, samt umodifiserte humant immunglobulin Fc G1. Denne robuste system utilizes et serumfritt medium som kan tilpasses for ekspresjon av isotopisk anrikede proteiner og karbohydrater for strukturelle studier ved hjelp av massespektrometri og kjernemagnetisk resonansspektroskopi. Videre kan sammensetningen av N-glykan være innstilt ved tilsetning av et lite molekyl for å hindre at visse sukker modifikasjoner på en måte som ikke reduserer utbyttet.

Introduction

Produsere høy avkastning av riktig brettet og post-translasjonelt modifiserte humane proteiner for detaljert analyse av struktur og funksjon er fortsatt en betydelig utfordring. Et stort antall ekspresjonssystemer er tilgjengelige som produserer rekombinante proteiner med naturlig-lignende funksjon og virkemåte. Bakterielle ekspresjonssystemer, hovedsakelig Escherichia coli-stammer, representerer de mest tilgjengelige og vanlige verktøy i forskning arenaen, på grunn av enkelheten i slike ekspresjonssystemer, skjønt gjær, planter, insekter og pattedyrsystemer er også beskrevet 1-4. Men de fleste av disse systemene er i stand til hensiktsmessige post-translasjonell modifikasjon av målproteinene. En grunnleggende interesse av Barb og Moremen laboratorier produserer eukaryote proteiner med passende glykosylering. Mange menneskelige proteiner kreve egnet glykosylering for riktig funksjon (se 5).

Den eukaryoteglykosylering maskiner er omfattende og i stand til å lage et variert utvalg av modifikasjoner, inkludert både asparagin (N) – og serin / treonin (O) -bundne komplekse glykaner 6. Det er anslått at> 50% av humane proteiner er N-glykosylert 7. Glykaner er essensielle komponenter av mange proteiner inkludert terapeutiske monoklonale antistoffer, erytropoietin og blodkoaguleringsfaktorer som faktor IX, for å nevne noen. Selv om flere metoder finnes for å forberede hensiktsmessig N-glykosylert proteiner og spenner fra rent syntetisk 8-10, til chemoenzymatic 11-14 eller utvinning fra konstruerte rekombinante systemer 15-20, ikke overraskende, har menneske ekspresjonssystemer så langt vist seg å være den mest robuste metoder for å generere humane proteiner.

Mange terapeutiske humane glykoproteiner produsert i rekombinante systemer ved bruk av pattedyrceller. Systemer av notatet er den kinesiske hamsterovarium (CHO), mus myelom (NS0), Baby Hamster Kidney (BHK), Human Embryonic Nyre (HEK-293) og menneske retinal cellelinjer som er ansatt i adhesjon eller suspensjon kultur for proteinproduksjon 4,21,22. Imidlertid har pattedyrprotein ekspresjonssystemer nødvendig å generere stabile cellelinjer, dyre vekstmedier og underlaget assistert transfeksjonsmidler prosedyrer 23.

Transfeksjon i pattedyrceller blir oppnådd ved hjelp av en rekke midler som omfatter kalsiumfosfater 24,25, kationiske polymerer (DEAE-dekstran, polybren, polylysin, polyethylimine (PEI)) eller positivt ladede kationiske liposomer 26-29. PEI er en polykationisk, ladet, lineær eller forgrenet polymer (25 kDa) 26 som danner et stabilt kompleks med DNA og endocytose. Ved surgjøring av endosomet, PEI er antatt å svelle, som fører til brudd av endosomer og frigjøring av DNA inn i cytoplasma 26,30.

Inntil nylig, transient transfeksjon i opphengningsi kultur ble utført ved forhånds DNA / PEI-kompleksdannelse, etterfulgt av tilsetning til cellekulturen 29. Men Würm og medarbeidere rapporterte en svært effektiv protokoll optimalisert for rekombinant proteinproduksjon i HEK293 celler som dannes en DNA / PEI kompleks in situ 31,32. Dette unngås fremstillingen, sterilisering av komplekset, og bufferbytte i et kulturmedium. Ytterligere optimalisering av blant annet uttrykk fremmende plasmider førte til betydelig avkastning øker 33. Heri er en metode som bygger på disse fremskrittene, og er bredt anvendelig. Expression forhold kan også endres for å påvirke N-glykan sammensetning.

Den HEK293S cellelinjen med et gen delesjon som stopper N-glykan prosessering på et mellomliggende trinn, fører til ekspresjon av proteiner med uniform N-glykaner som består av 2-N-acetylglucosaminrester pluss fem mannoserester (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Disse cellenemangler den N-acetylglucosaminyl transferase I (GntI) genet som er nødvendig for nedstrøms N-glykan prosessering 36,37. Bruken av glykosyltransferase-inhibitorer, inkludert kifunensine, sialinsyre-analoger og fucose analog og 2-deoksy-2-fluor-fukose har lignende virkninger og begrensninger N-glykan prosesserings 38-41.

Av protokollen angitt her benytter pGEn2 vektoren som vist i figur 1 42,43, PEI assistert forbigående transfeksjon inn i pattedyrcellelinjer (HEK293F eller HEK293S celler), og gjenvinning av høye utbytter av korrekt glykosylert protein. Dette systemet er robust og kan romme ulike faktorer, inkludert isotop merking og glykan teknikk for fremstilling av store titere av rekombinante proteiner.

Protocol

Denne protokollen er tilstrekkelig for uttrykk ved hjelp av enten HEK293F eller HEK293S celler. 1. Cell Establishment Kultur Inoculation Merk: Alle kultur manipulasjon prosedyrer må utføres i en BSL-2 anlegg og hvert element bringes inn i biosikkerhet kabinettet må steriliseres ved sprøyting med 70% etanol i vann. Betjene risteinkubator ved 135 rpm, 80% fuktighet og 8,0% CO2 og 37 ° C. Slå "på" UV-lampen av biosikkerhet kabinettet minst en time før du arbei…

Representative Results

Høy-nivå protein ekspresjon og renhet Denne optimaliserte ekspresjonssystemet ga et høyt utbytte av glykosylerte proteiner. Et typisk mønster er vist i uttrykket av IgG1-Fc (Figur 1). I dette tilfellet, dag 0 er transfeksjon dag, etterfulgt av en dag (fortynning) og etterfølgende kultur dager opp til dag 5. Protein ekspresjon ble analysert ved hjelp av den oppløselige fraksjon uttrykket i råoljen medium…

Discussion

Denne protokollen illustrerer protein uttrykk via transient transfeksjon av HEK293F eller S-celler. De optimale transfeksjonsmidler vilkårene fastsatt i Barb og Moremen labs ansette en kritisk kombinasjon av celletetthet og reagenskonsentrasjoner å oppnå høy effektivitet transfeksjon. Kritiske betraktninger når denne protokollen er: å opprettholde en stabil kultur før transfeksjon (med enhetlig kultur dobling ganger); transfeksjon av aktivt voksende celler (oppnådd ved fortynning av cellene til 1 x 10 6 cel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble finansielt støttet av tilskuddene K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) og P01GM107012 (KWM) fra National Institutes of Health, og ved midler fra Roy J. Carver Avdeling for biokjemi, biofysikk og molekylær biologi ved Iowa State University . Innholdet i dette arbeidet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av NIH.

Materials

Biosafety cabinet  NuAire, Inc. CellGard ES NU-S475-400 Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shaker INFORS HT Multitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium  Life Technologies 12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium  SIGMA 14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431144
FreeStyle HEK 293F Cells Life Technologies R790-07
1 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10B
10 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10J
25 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP) Drummond Scientific 161263
Trypan Blue Solution  Thermo Scientific  SV30084.01
Counting slides  Bio-Rad 145-0011
TC20 Automated Cell Counter  Bio-Rad  145-0102
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc. 23966 Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) EMD Chemicals Inc. 7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μM Fisher Scietific 09-719A
Trisaminomethane (Tris base) Fisher Scietific BP152-1
XL1-Blue Stratagene 222249
Trypton Fisher Scietific BP1421-2
Yeast extract Fluka Analytical  92144
Sodium chloride BDH chemicals BDH8014
Plasmid Purification Kit QIAGEN 12145
Valproic (VPA) SIGMA P4543 Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
Corning 250 mL Centrifuge Tube  Corning Incorporated/Life Sciences 430776
Centrifuge Thermo Scientific  EW-17707-65
Protein A-Sepharose column SIGMA P9424
Ni-NTA superflow QIAGEN 30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Fisher Scietific BP308-500
Glycine Fisher Scietific BP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters  Millipore UFC901096
Sodium dodecyl sulfate ALDRICH L3771
Beta-mercaptoethanol ALDRICH M6250
Glycerol SIGMA G5516
Precision Plus Protein All Blue Standards Bio-Rad 161-0373
Acetic Acid, Glacial  Fisher Scietific 64-19-7
coomassie brilliant blue  Bio-Rad  161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO  Applied Biosystems
15N labeled L-Tyrosine ALDRICH 332151
15N labeled L-Lysine ALDRICH 592900
Unlabeled L-Phenylalanine SIGMA-ALDRICH P2126
13C6-Glucose ALDRICH 389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose  SANTA CRUZ Biotechnology sc-283123

References

  1. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  2. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
  3. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
  5. Varki, A. . Essentials of Glycobiology. , (2009).
  6. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  7. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  8. Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
  9. Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
  10. Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
  11. Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
  12. Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
  13. Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
  14. Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
  15. Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
  16. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
  17. Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
  18. Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
  19. Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
  20. Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
  21. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  22. Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
  23. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  24. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
  25. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
  26. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  27. Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
  28. Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
  29. Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
  30. Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
  31. Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
  32. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
  33. Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
  34. Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
  35. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
  36. Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine–glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
  37. Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
  38. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  39. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
  40. Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
  41. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  42. Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry. 51 (22), 4618-4626 (2012).
  43. Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
  44. Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochemistry. 48 (41), 9705-9707 (2009).
  45. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
  46. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  47. Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
  48. Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
  49. Kaufman, S. M. A. A. R. J., Makrides, S. C. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. 38, 411-432 (2003).
  50. Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
  51. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
  52. Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochemistry. 54 (2), 313-322 (2015).
check_url/53568?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. W. High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. J. Vis. Exp. (106), e53568, doi:10.3791/53568 (2015).

View Video