Sikkerhetstiltak og driftsprosedyrer i en (A) BSL-4 Laboratorium: 2. Generelle Practices
Summary
Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.
Abstract
Arbeid i et biosikkerhetsnivå 4 (BSL-4) oppdemming laboratorium krever tid og stor oppmerksomhet på detaljer. Det samme arbeidet som er gjort i en BSL-2 laboratorium med non-high-konsekvens patogener vil ta betydelig lenger i en BSL-4 setting. Denne økte tidskrav er på grunn av en rekke faktorer som er rettet mot å beskytte forsker fra laboratorieinfeksjoner, arbeidsmiljøet mot mulig forurensning og lokalsamfunnet fra mulig frigjøring av høy konsekvens patogener. Inne i laboratoriet, er bevegelsen begrenset på grunn av luftslanger festet til de obligatoriske kropps sikkerhetsdrakter. I tillegg er desinfeksjon av hvert element som er fjernet fra klasse II biosikkerhet skap (BSC) nødvendig. Laboratorie spesialister må trenes i praksis av BSL-4 laboratorium, og må vise høy kompetanse i ferdigheter de utfører. Fokuset i denne artikkelen er å skissere riktige prosedyrer og teknikker for å sikre laboratorium biosafety og eksperimentell nøyaktighet ved anvendelse av en standard virus-plaque-analysen som et eksempel prosedyre. Spesielt til riktige teknikker arbeide trygt i en BSL-4-miljø når du utfører et eksperiment vil bli visuelt vektlagt. Disse teknikkene inkluderer: å sette opp en klasse II BSC for eksperimenter, riktig rengjøring av klasse II BSC når du er ferdig å jobbe, avfallshåndtering og trygg avhending av avfall inne i en BSL-4 laboratorium, og fjerning av inaktiverte prøver fra inne i en BSL- 4 laboratorium til laboratorium BSL-2.
Introduction
Som sikkerhet for laboratoriepersonell som håndterer høy konsekvens patogener (ingen infeksjon prophylaxes eller behandlingstilbud finnes) er viktig, har det amerikanske Department of Health and Human Services fastsatt retningslinjer for bygging og installasjon og beste praksis for sikker utføring av arbeid med patogener i biomedisinsk og kliniske laboratorier fra et biosikkerhet perspektiv en. Gjennom lovgivning og regulering, mange av de rutiner og prosedyrer er blitt obligatoriske krav som må følges for arbeid med disse patogener. I USA patogener som er lett overføres fra person til person, resultere i høye letalitet priser, og / eller har potensial for stor innvirkning på folkehelsen og bioterrorisme, er kategorisert som National Institute of Health / National Institute of Allergy og smittsomme sykdom (NIH / NIAID) Prioritet A patogener og eller Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bioterrorisme Kategori A Agents 2. I tillegg high-konsekvens patogener er klassifisert som Tier 1 Velg Agents hvis disse patogener er potensielle bekjempe bioterrorisme agenter, har potensiale for masse havarier eller ødeleggende effekter på økonomien, kritisk infrastruktur, eller tillit tre.
BSL-4 operasjoner, inkludert tilgang til institutter med BSL-4 laboratorier, er mer svært kontrollert enn BSL-2/3 operasjoner. For eksempel er det vesentlig vanskeligere å få tilgang til en BSL-4 laboratorium i forhold til en BSL-2 eller BSL-3 laboratorium på grunn av betydelige dress krav til opplæring, omfattende mentorer krav, og ytterligere medisinsk biologisk forutsetninger. I tillegg er det vanligvis flere fysiske sikkerhetsbarrierer i et BSL-4- versus en BSL-2 eller BSL-3-anlegget 4-6. Som beskrevet i vår første artikkel om BSL-4 Åpnings- og avslutningsprosedyrer, laboratoriepersonell gjennomgå omfattende opplæring og psykologisk screening for å kvalifisere for inngangen til BSL-4 laboratorium 7. WTVen på BSL-4 laboratorium, er risikoen for infeksjoner og feil unngås eller reduseres ved å følge etablerte prosedyrer. Forskningen må gå forsiktig og bevisst, med minimal multitasking eller distraksjoner. Bøyd over i overtrykks dresser er vanskelig, og visir kan begrense prosedyrer som mikroskopi. Klumpete hansker hindre utførelsen av finmotoriske oppgaver, for eksempel håndtering av små gjenstander eller merking rør. For å minimere tiden brukt i BSL-4 laboratorier, bør laboratorie eksperter vurderer arbeidsprosedyrer for å identifisere tiltak som kan gjøres videre i en BSL-2 laboratoriet og deretter transportere disse materialene inn i BSL-4 laboratorium for gjennomføring av oppgaven (e). Ved fjerning av materialer for videre bearbeiding i BSL-2 laboratorium, blir materialene fast og fjernet fra BSL-4-laboratoriet i en forseglet sekundær beholder. Eksempler på prøver som kanskje må fjernes er: faste plater eller rør av infisert materiale som vil bli analysert ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA), immunofluorescens-analyse (IFA) eller polymerase kjedereaksjon (PCR).
I tillegg til større fysiske begrensninger som følger av personlig verneutstyr som kreves i BSL-4 laboratorier i forhold til de i BSL-2 laboratorier, rutiner for inaktivering av høy konsekvens patogener i cellekulturplater og avfallshåndtering er strengere enn de som trengs for mindre patogene virus undersøkt i en BSL-2 laboratorium. Som et minimum bør disse metodene oppfyller CDC kravet. For eksempel kan forurensede cellekulturplater og andre materialer bli inaktivert med kjemiske reagenser, så som nøytral bufret formalin. Behandlede cellekulturplater eller rør som skal plasseres i et varmeforseglet poser inneholdende formalin og fjernet fra laboratoriet via en dunk tank fylt med en væske desinfeksjonsmiddel. Avfalls bøtter fylt med desinfeksjonsløsninger og spray desinfeksjonsmidler brukes for midlertidig mottak av avfall som genereres under forsøket og for desinfisenfecting hansker, rengjøring biosikkerhet skap overflater og instrumenter, henholdsvis. Kvartær ammonium desinfeksjonsmiddel på konsentrasjon oppført regnes som gullstandarden for alle amerikanske BSL-4 laboratorier (Barr J, personlig kommunikasjon, 2015). Fast avfall fra et avfalls bøtte autoklaveres å eliminere muligheten for forurensning.
I et forsøk for å demonstrere visuelt arbeidsflyten og begrensningene ved de generelle BSL-4 prosedyrer, anvendte vi en standard virus-plaque-analysen som et eksempel på et vanlig brukt viral prosedyre. Mens den virale analyseprosedyren er beskrevet generelt, stress vi biologisk prosedyrer som brukes for å sikre sikkerheten av laboratoriepersonale i denne protokollen. Vennligst referer til tidligere klassiske plakkassay visualiseringer for ytterligere bakgrunns på plakett analyseteknikken 8,9.
Prosedyrene som presenteres her følger BMBL spesifikasjoner skissert av CDC en. Men de presenterte protokoller erspesifikk for IRF-Frederick. Hver BSL-4-anlegget har forskjellige standard operasjonsprosedyrer (SOP) og driftsmetoder som påvirker gjennomføring av eksperimenter innenfor BSL-4 laboratorium. Alternative prosedyrer for avfallsstrømmen styring og gjennomføring av plakk analyser kan variere basert på forvaltning og drift av disse laboratoriene. Likevel vil en generell forståelse av oppsettet av en BSL-4 dress laboratorium og prosedyrer for å utføre arbeid med klasse II skap inne i BSL-4 miljø hjelpe forskerne å forstå de begrensninger og sikkerhetsmessige implikasjoner når som vurderer studier av høyrisiko patogener. Økt bevissthet om utenfor samarbeidspartnere av vanskelighetene rundt arbeidet i en BSL-4 laboratorium kan føre til justerte forventninger og større letthet i å utvikle medisinske mottiltak i forskersamfunnet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Arbeid i en BSL-4 laboratorium krever mye tid og ekstra oppmerksomhet på detaljer. Enhver type arbeid i dette miljøet krever godt trent, grundig og samvittighetsfulle individer. Standarden viral plakkassay gir en nøyaktig modell av en vanlig prosedyre for å arbeide med høy konsekvens patogener i BSL-4 laboratorium, som analysen omfatter flere store konsepter som laboratoriearbeidere må læres.
Den første store konseptet er riktig bruk og anvendelse av sikker praksis i klasse II BSC, s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute’s prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: S.M. as an employee of MRI Global; M.G.L. as an employee of Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; and J.H.K. as an employee of Tunnell Government Services, Inc.
Materials
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| 2-ml 96-Deep Well Plates | Fisher | 278743 | |
| 10-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11E | |
| 25-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11 | |
| 6-well plates | Fisher | 140675 | |
| Crystal Violet | Sigma | HT90132-1L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 22-050-105 | |
| Tragacanth | Fisher | 50-702-2000 | |
| 20-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-550 | |
| 200-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-561 | |
| 1000-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-581 | |
| DMEM | Lonza | 12-604Q | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| 2X EMEM | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Pipettor | Drummond | 4-000-101 | |
| 1000-μl Pipette | Rainin | L-1000XLS+ | |
| 200-μl Pipette | Rainin | L-200XLS+ | |
| 12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor | Rainin | L12-200XLS+ | |
| 8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor | Rainin | LA8-1200XLS | |
| Attest | Express Medical Supplies | MMM12192 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Autoclave Bag | Fisher | 01-828E | |
| 2000-ml Beaker | Fisher | 02-591-10H | |
| Autoclave Tray | Fisher | 13-359-20B | |
| Pipette Tray | Fisher | 13-361-5 | |
| 37°C Incubator | Fisher | WU-39321-00 | |
| Biohazard Can | Rubbermaid Commercial | FG614500 RED | |
| Autoclave Tape | Fisher | 15-903 | |
| Autoclave Rod | Made by IRF Facility | N/A | |
| Light Box | Fisher | S11552 | |
| Heat Sealer | Fisher | NC9793612 | |
| Heat Seal Pouches | Fisher | 01-812-25H | |
| Biohazard Bag | Fisher | 01-828E |
References
- Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
- de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
- Keith, L., Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. , (2014).
- Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. , (2015).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. , e52065 (2014).
- Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. , e4297 (2012).
- Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. , (2015).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).
