在脉冲激光激发金纳米粒子集成光电响应脂质体及其微泡空化的测量的合成

Summary

这个协议描述了金纳米颗粒集成光响应的脂质体与市售材料的简单制备方法。这也说明了如何在脉冲激光治疗测量合成脂质体的微泡空化进程。

Abstract

光响应纳米颗粒 （NPs） 因其在提供药物释放的空间、时间和剂量控制方面的潜力而受到广泛关注。然而，大多数相关技术仍处于开发过程中，临床无法采购。在这里，我们描述了用市售金 NP 和热响应脂质体轻松制造这些光响应 NP。钙黄绿素用作模型药物来评估热/光刺激下的包封效率和释放动力学特征。最后，我们表明这种光触发释放是由于微气泡空化引起的膜破坏，这可以用水听器测量。

Introduction

可能使用外部的刺激是一个有吸引力的方式为客户提供药物以最大的特异性和最小的不利影响spatial-，temporal-和剂量控制的时装来触发药物释放。之间广泛的外源刺激响应系统（光，磁场，超声波，微波辐射），光触发的平台是有吸引力的，因为它们的非侵入性，简便性和适应性的诊所。在过去的十年¹广泛的研究已经提供了各种平台技术，例如近红外光负责金的涂有智能聚合物（Au）的纳米笼，用药物^，3和自组装porphysome纳米囊泡共轭²对光不稳定的，聚合物纳米颗粒（纳米颗粒^）。4但是这些技术仍处于发展的临床前阶段，要求参与发起和续的工艺参数清醒的认识和优化滚动药物的释放。

一种用于制备这种系统的最简单和方便的方法是对金纳米粒子与热敏感脂质体^5,6，这两者都是在市场上广泛使用，并已在临床前和甚至临床试验被广泛地研究集成。尽管金纳米粒子的深层组织活化的在其电浆波长的限制，相对于近红外活化的Au纳米结构（例如，纳米笼），在小动物或用于人类局部递送时使用该系统仍然保持很大的希望。 ⁷中有金纳米粒子与脂质体相结合的用于光触发释放一些早期的努力^。8-11虽然大多集中在材料的新颖性，需要解决可访问性和可扩展性的问题。此外，在使用这些纳米载体释放机构的报告仍然有限。

Protocol

1.准备

1. 干净的100毫升园使用王水（浓硝酸1份（HNO _3）和3份浓盐酸（HCl）的）中，用DI水冲洗烧瓶底部的烧瓶中。高压灭菌的烧瓶中并在100℃干燥它们在热空气烘箱中15分钟。换并存储无菌瓶中直至使用。
2. 消毒用70％的乙醇手持微型挤出集。
3. 打开旋转蒸发器和分别在37℃和4℃设置热水浴中冷却塔的温度。
4. 由374毫克的钙黄绿素溶解在0.1毫10毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）中制备60mM的钙黄绿素储备溶液。调整使用1M氢氧化钠（NaOH）溶液的pH至7.4。

2.脂质体的合成

1. 除去脂质（1,2- Dipalmitoyl- SN -glycero -3-磷酸胆碱（DPPC），1-棕榈酰-2-羟基- SN -glycero -3- phosphocho线（MPPC）和1，2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanol-胺-N - [羧基（聚乙二醇）-2000]（铵盐）（DSPE-PEG2000））从冷冻机（-20℃）和它们解冻至室温。
2. 称重15.9毫克DPPC，1.3毫克MPPC，和2.8毫克DSPE-PEG2000。在2ml氯仿溶解在一起。
3. 转移氯仿溶液至无菌圆底烧瓶中，并用减压旋转蒸发....

Results

10:4:4或7.95:使用具有DPPC，MPPC和DSPE-PEG2000的常规薄膜水化技术中的86摩尔比制备的脂质体0.65:1.39毫克/毫升¹²金纳米粒子的大小是至关重要的，以确定所述光下面激光激发实验期间加热的转换效率。金纳米粒子的尺寸小，高为¹³因此为5nm金纳米粒子，从供应商的最小样本，被选择为包封传感效率。在合成过程中，加入含有金纳米粒子和水合介质钙黄绿素生成多层状囊泡中，将其受到大小挤出和凝胶过滤层析以除去游离的金纳米粒子和钙黄绿素。

钙黄绿素是亲水性荧光染料在60毫浓度的脂质体的水性核心内包封。在这样高的浓度，C的荧光alcein自淬灭。然而，因为它是从脂质体释放，从而导致荧光重新增益钙黄绿素被稀释，指示触发药物释放^。14依托钙黄绿素的脂质体的这种特性中稀释至5mM和脂质体系统的对温度变化的响应是观察到的。 如图 2A中

Discussion

薄膜水化是用于制备脂质体的常规方法。有机溶剂（在这种情况下，氯仿）首先用于溶解脂质，然后取出在旋转蒸发器于37℃，以产生在烧瓶的脂质薄膜。此脂质膜用含有60mM的钙黄绿素和5纳米金纳米粒子水溶液水合。在水合过程中，将温度维持在大约50℃，将该烧瓶不断受到烧瓶旋转搅拌。该步骤中的关键是在其中的蒸发和水合分别进行温度的选择。 DPPC，脂质体的主要成分，所述的相变温度（T _m）为 41℃。在脂质的形成认为薄膜时，温度应低于41℃，以防止干燥脂类聚集团块的形成。在水化，被选择更高的温度比_Tm值来驱动磷脂自组装成球形多层结构。虽然薄膜水化方法容易进行，它是通过在水溶液中的钙黄绿素和金纳米粒子的包封率差（<1％）的限制。在未来，封装可能通过冻融得到改善。

随后大小挤出用手持小型挤出机，置于加热块上完成的。最多1毫升溶液可使用这种设置，这是理想的，在实验室小规模制备挤出。在这个步骤中的关键仍然是温度，这应高于脂质体的相变温度。通过在50℃下递挤出，脂质体的大小通过膜成为挤压的10次循环后均匀的200纳米的孔。在这个步骤中的运动应该是缓慢和轻柔的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 （DPPC）	Avanti Polar Lipids （美国阿拉巴马州）	850355P	粉末，在 -20 °C 下储存;C
1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱 （MPPC）	Avanti 极性脂质（美国阿拉巴马州）	855675P	粉末，储存在 -20 °;C
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇-胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（铵盐）（DSPE-PEG2000）	Avanti Polar Lipids（美国阿拉巴马州）	880120P	粉末，储存在-20°C;C
金纳米颗粒	Sigma Aldrich	752568-100mL	5 nm 颗粒，稳定在 0.1 mM PBS
钙黄绿素	Sigma Aldrich	C0875-10g	60 mM，pH 7.4（使用 NaOH 调节）
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Sigma Aldrich	P5493	0.1 mM，pH 7.4
双蒸水	Millipore Milli-DI 净水系统
Triton X100	Sigma， 生命科学	X-100	破坏脂质体以计算总包
埋旋转蒸发仪	Buchi （瑞士）	R 210	用于脂肪膜制备
加热浴	Buchi （瑞士）	B 491	用于脂肪膜制备
真空控制器	Buchi （瑞士）	V-850	用于脂肪冶金制备
真空泵	Buchi （瑞士）	V-700	用于脂肪冶金制备
带温度控制器的再循环浴	Polyscience		用于脂肪冶金制备
带加热块的微型挤出机组件	Avanti Polar Lipids （美国阿拉巴马州）	610000	用于脂质体注射器的挤出
，1,000 μl	Avanti Polar Lipids （美国阿拉巴马州）	610017	用于脂质体的挤出
聚碳酸酯滤膜， 200 nm	Whatmann	800281	用于脂质体的挤出
过滤器支架	Avanti Polar Lipids（美国阿拉巴马州）	610014	用于脂质体的挤出
PD 10 脱盐腔，Sephadex G-25 培养基	GE Healthcare，生命科学	17-0851-01	用于纯化脂质体
离心机	Sigma 实验室离心机	3K30	用于浓缩脂质体溶液
转子	Sigma	19777-H	用于浓缩脂质体溶液
Zetasizer	纳米 ZS Malvern		用于测定脂质体大小和锌均能值
紫外可见分光光度计	Shimadzu	UV-2450	用于测量样品的吸光度
荧光分光光度计	Molecular Devices	SpectraMax M5	用于测量样品的荧光发射
Nd：YAG 激光器	NewWave Research		532 nm;最大功率：17 mJ;宽度： 406 NSEC;用于样品照射
HNR 水听器	ONDA	HNR-1000	直径为 1 mm，灵敏度为 450 nV/Pa，适用工作频率范围：0.25-10 兆赫;校准：50 mV/巴;用于测量声学信号
数字示波器	LECORY - Wave Runner 64Xi-A		频率：600 MHz;最大采样率：10 Gs/sec（双通道）;用于记录测得的声信号