Imagem raciométrica de pH extracelular no biofilme dentário
Summary
Um corante raciométrica sensível ao pH é utilizado em combinação com a microscopia de varrimento a laser confocal e análise de imagem digital para monitorar o pH extracelular em biofilmes dentários em tempo real.
Abstract
O pH em biofilmes bacterianas nos dentes é de importância central para a cárie dentária, uma doença com alta prevalência em todo o mundo. Nutrientes e metabólitos não são distribuídas uniformemente em biofilmes dentais. Uma interacção complexa de sorção de reacção e com a matéria orgânica no biofilme reduz os caminhos de difusão de solutos e cria gradientes íngremes de moléculas reactivas, incluindo os ácidos orgânicos, entre os biofilme. métodos microscópicos fluorescentes quantitativos, tais como a imagiologia de tempo de vida de fluorescência ou ratiometry pH, pode ser utilizado para visualizar o pH em diferentes microambientes de biofilmes dentais. pH ratiometry explora um deslocamento dependente do pH na emissão de fluorescência de corantes sensíveis ao pH. O cálculo da razão de emissão em dois comprimentos de onda diferentes permite a determinação do pH local em imagens microscópicas, independentemente da concentração do corante. Contrariamente ao microeléctrodos a técnica permite monitorar ambos os gradientes de pH verticais e horizontais em tempo real commecanicamente perturbar o biofilme. No entanto, é preciso ter cuidado para diferenciar com precisão entre os compartimentos extra e intracelulares do biofilme. Aqui, o corante raciométrica, seminaphthorhodafluor 4F-5- (e-6) ácido carboxílico (C-SNARF-4) é empregue para monitorizar o pH extracelular in vivo em biofilmes dentais cultivadas espécies de composição desconhecida. Após a exposição a glicose do corante é up-concentrada dentro de todas as células bacterianas nos biofilmes; É, assim, usado tanto como uma mancha universal de bactérias e como um marcador do pH extracelular. Após a aquisição da imagem microscópica confocal, a biomassa bacteriana é removida de todas as fotos usando o software de análise de imagem digital, que permite calcular exclusivamente pH extracelular. ratiometry pH com o corante proporcional está bem adequado para o estudo do pH extracelular em biofilmes finos de até 75 um de espessura, mas está limitada ao intervalo de pH entre 4,5 e 7,0.
Introduction
O método descrito aqui permite a monitorização do pH extracelular em biofilmes dentais na gama entre 4,5 e 7, utilizando o corante raciométrica seminaphthorhodafluor 4F-5- (e-6) ácido carboxílico (C-SNARF-4), em combinação com a microscopia de varrimento a laser confocal e análise de imagem digital. O corante fluorescente empregue é sensível ao pH e exibe uma mudança na sua emissão fluorescente, dependendo do estado de protonação. A emissão fluorescente dos picos de moléculas protonadas a 580 nm, e a emissão da molécula desprotonado em 640 nm 1. A razão entre as intensidades de emissão fluorescente em duas janelas de detecção que compreende os dois picos de emissão (576-608 nm e 629-661 nm) reflecte, portanto, o pH na fase líquida, independentemente da concentração de corante. Com um valor de pKa de 6,4 ~ o corante é adequado para visualização em ambientes de pH moderadamente ácidas.
PH no biofilme bacteriano é de importância central para todos os processos metabólicos.No caso de biofilmes dentais, o pH na matriz extracelular é o factor de virulência chave para o desenvolvimento de cárie dentária. Longos períodos com pH baixo na liderança interface de biofilme-tooth para retardar a desmineralização do esmalte subjacente 2. Devido à arquitectura tridimensional complexa de biofilmes, metabolitos, incluindo os ácidos orgânicos, não são uniformemente distribuídos através do biofilme. Altamente e menos microambientes acidogênicas pode ser encontrada em estreita proximidade espacial 3.
Durante décadas, os gradientes de pH verticais em biofilmes foram gravadas com a ajuda de microeletrodos 4-6. Enquanto eles oferecem uma boa resolução espacial devido ao seu tamanho pequeno ponta, eles não são adequados para monitorar gradientes horizontais. Além disso, a inserção do eléctrodo perturba o biofilme mecanicamente. técnicas microscópicas fluorescentes quantitativos oferecem a vantagem de visualizar mudanças de pH em diferentes áreas de um biofilme sem interferir mecânicance. Diferentes campos de vista microscópico pode ser escolhido livremente e fotografada várias vezes ao longo de períodos prolongados 1,7-9. No entanto, ao interpretar imagens microscópicas de biofilme, é importante fazer a distinção entre a fluorescência derivada da biomassa microbiana e a fluorescência resultante a partir do espaço extracelular. Em condições acídicas, o pH no interior das células bacterianas é diferente do pH na matriz extracelular, como as bactérias transportar activamente protões através sua membrana celular à custa de adenosina trifosfato 10. No contexto da cárie dentária, pH bacteriana intracelular não tem um impacto direto sobre o esmalte subjacentes enquanto baixo pH extracelular leva a desmineralização. Média de pH em imagens microscópicas que contêm ambas as áreas e bactérias livres de bactérias leva a resultados errados. A utilização de outras manchas, juntamente com o corante sensível ao pH, a fim de visualizar a biomassa bacteriana e diferenciar entre as áreas extra e intracelulares traz abo risco de contaminação de fluorescência do espaço extracelular e erros de medição 11.
Por conseguinte, o presente manuscrito descreve a utilização do corante raciométrica numa função dupla; tanto como um marcador de pH e como uma mancha universal de bactérias. Como o corante é-se concentrado em células bacterianas, a combinação de imagem microscópica confocal e um processo de análise de imagem digital preciso permite determinar o pH extracelular no intervalo entre 4,5 e 7,0 em biofilmes finos dentários.
Protocol
Representative Results
Discussion
Monitorização microscópica de pH biofilme proporciona várias vantagens, como comparado com eléctrodos ou microeléctrodos 4-6 medições. técnicas microscópicas permitir determinar pH com uma alta resolução espacial e permitir a captura gradientes de pH horizontais e verticais em biofilmes sem perturbar o biofilme mecanicamente. As tentativas anteriores de monitoramento do pH microscópico, no entanto, não conseguiram diferenciar entre pH extracelular e intracelular no biofilme 1,7,9. Dev…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Javier E. Garcia e Lene Grønkjær de assistência técnica e Merete K. Raarup para discussões frutíferas. Este trabalho foi financiado pelo Aarhus University Research Foundation eo Simon Spies Foundation.
Materials
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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