Логометрический визуализации внеклеточного рН в зубных биопленок
Summary
РН-чувствительный ратиометрический краситель используется в сочетании с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и анализа цифровых изображений для мониторинга внеклеточный рН в зубных биопленок в реальном времени.
Abstract
РН в бактериальных биопленок на зубах имеет центральное значение для кариеса, болезни с высоким во всем мире распространенности. Питательные вещества и метаболиты не распределены равномерно в зубных биопленок. Сложное взаимодействие сорбции и реакции с органическими веществами в биопленки снижает диффузионные пути растворенных веществ и создает крутые градиенты реактивных молекул, в том числе органических кислот, через биопленку. Количественные флуоресцентные микроскопические методы, такие как флуоресценция жизни времени изображений или рН ratiometry, могут быть использованы для визуализации рН в различных микросреды зубных биопленок. рН ratiometry использует рН-зависимого сдвига в флуоресцентного излучения рН-чувствительных красителей. Расчет коэффициента эмиссии на двух различных длинах волн позволяет определить локальные значения рН в микроскопических изображений, независимо от концентрации красителя. В отличие от микроэлектродов метод позволяет осуществлять мониторинг как вертикальные, так и горизонтальные градиенты рН в реальном времени смеханически нарушая биопленки. Тем не менее, следует соблюдать осторожность, чтобы дифференцировать точно между вне- и внутриклеточным биопленки. Здесь Логометрический краситель, seminaphthorhodafluor-4F 5- (а-6) карбоновой кислоты (С-Snarf-4) используется для мониторинга внеклеточный рН в естественных условиях , выращенных в зубных биопленок неизвестного видового состава. При воздействии на глюкозу краситель вверх сосредоточено внутри всех бактериальных клеток в биопленки; она, таким образом, используется как в качестве универсального бактериального окрашивания и в качестве маркера внеклеточного рН. После того, как конфокальной микроскопического захвата изображений, бактериальная биомасса удаляется из всех изображений с помощью программного обеспечения цифрового анализа изображений, который позволяет исключительно рассчитать внеклеточного рН. рН ratiometry с логометрической красителя хорошо подходит для изучения внеклеточный рН в тонких биопленок толщиной до 75 мкм, но ограничена диапазоном рН от 4,5 до 7,0.
Introduction
Описанный здесь метод позволяет осуществлять мониторинг внеклеточный рН в зубных биопленок в диапазоне от 4,5 до 7, с использованием Логометрический краситель seminaphthorhodafluor-4F 5- (а-6) карбоновой кислоты (С-Snarf-4) в сочетании с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и цифрового анализа изображений. Примененный флуоресцентный краситель рН-чувствительный и отображает сдвиг в его флуоресцентного излучения в зависимости от состояния протонирования. Флуоресцентное излучение протонированных пиков молекул при 580 нм, а излучение депротонированным молекулы при 640 нм 1. Отношение флуоресцентных интенсивностей излучения в двух окнах обнаружения содержит два пика излучения (576 – 608 нм и 629 – 661 нм), таким образом, отражает значение рН в жидкой фазе, независимо от концентрации красителя. С рК а ~ 6,4 краситель подходит для визуализации рН в умеренно кислой среде.
PH в бактериальных биопленок имеет центральное значение для всех метаболических процессов.В случае зубных биопленок, рН во внеклеточной матрице является ключевым фактором вирулентности для развития кариеса зубов. Длительные периоды с низким рН на границе раздела свинца биопленки зуба , чтобы замедлить деминерализации эмали подстилающей 2. Из-за сложной трехмерной архитектурой биопленок, метаболитов, в том числе органические кислоты, не распределены равномерно по всему биопленки. Высоко и менее кислотопродуцирующий микросреды могут быть найдены в непосредственной пространственной близости 3.
В течение многих десятилетий, вертикальные градиенты рН в биопленки были записаны с помощью микроэлектродов 4-6. Несмотря на то, что они предлагают хорошее пространственное разрешение из-за их небольшого размера наконечника, они не очень хорошо подходят для контроля горизонтальных градиентов. Кроме того, введение электрода нарушает биопленку механически. Количественные флуоресцентные методы микроскопии обеспечивают преимущество визуализации изменений рН в различных областях биопленки без механического интерферироватьсть. Различные микроскопические поля зрения могут быть выбраны свободно и повторно отображены в течение длительных периодов 1,7-9. Тем не менее, при интерпретации микроскопических биопленки изображений, важно проводить различие между флуоресценцией, вытекающей из микробной биомассы и флуоресценции, вытекающей из внеклеточного пространства. В кислой среде, рН внутри бактериальных клеток отличается от рН в внеклеточного матрикса, так как бактерии активно транспортируют протонов через их клеточную мембрану за счет аденозинтрифосфата 10. В контексте кариеса, внутриклеточная бактериальная рН не оказывают непосредственное влияние на нижележащих эмали, тогда как низкий внеклеточного рН приводит к деминерализации. Усреднение рН в микроскопических изображений, которые содержат как бактерии участков, свободных и бактерий приводит к ошибочным результатам. Использование других пятен наряду с рН-чувствительного красителя для визуализации бактериальной биомассы и различия между вне- и внутриклеточных областей приносит абиз – за риска флуоресцентного загрязнения внеклеточного пространства и ложных измерений 11.
Поэтому в настоящем рукопись описывает использование Логометрический красителя в двойной функции; как в качестве рН-маркера и в качестве универсального бактериального окрашивания. По мере того как краска повышающего концентрируется в бактериальных клетках, сочетание конфокальной микроскопических изображений и точная процедура анализа цифровых изображений позволяет определить внеклеточный рН в интервале между 4,5 и 7,0 в тонких зубных биопленок.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроскопический контроль биопленки рН обеспечивает ряд преимуществ, по сравнению с электродными или микроэлектродов измерений 4-6. Микроскопические методы позволяют определить рН с высоким пространственным разрешением и позволяет захватывать горизонтальные и вертикальные г?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Хавьер Гарсиа и Е. Лене Груншер об оказании технической помощи и Мерете К. Raarup за плодотворные дискуссии. Эта работа финансировалась исследовательского фонда Университета Орхус и Simon Spies Foundation.
Materials
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Takahashi, N., Nyvad, B. Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process. Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).
- von Ohle, O. C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Revsbech, N. P. Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors. Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).
- Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. Iridium oxide pH microelectrode. Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy & Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).
- Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci. Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).
- Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).
- Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries. Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).
