Ratiometrisk Imaging af ekstracellulære pH i Dental biofilm

Summary

En pH-følsom ratiometrisk farvestof anvendes i kombination med konfokal laser scanning mikroskopi og digital billedanalyse til at overvåge ekstracellulær pH ​​i dental biofilm i realtid.

Abstract

PH i bakterielle biofilm på tænderne er af central betydning for caries, en sygdom med en høj forekomst på verdensplan. Næringsstoffer og metabolitter ikke jævnt fordelt i dental biofilm. Et komplekst samspil af sorption til og reaktion med organisk stof i biofilmen reducerer diffusion stier opløste stoffer og skaber stejle stigninger af reaktive molekyler, herunder organiske syrer, på tværs af biofilmen. Kvantitative fluorescerende mikroskopiske metoder, såsom fluorescens levetid billeddannelse eller pH ratiometry, kan anvendes til at visualisere pH i forskellige mikromiljøer af tand biofilm. pH ratiometry udnytter en pH-afhængig forskydning i fluorescerende emission af pH-følsomme farvestoffer. Beregning af forholdet emission ved to forskellige bølgelængder tillader bestemmelse af lokale pH i mikroskopiske billeder, uanset koncentrationen af ​​farvestoffet. I modsætning til mikroelektroder teknikken tillader overvågning både lodrette og vandrette pH-gradienter i realtid medmekanisk forstyrre biofilmen. Imidlertid skal der drages omsorg for at skelne klart mellem ekstra- og intracellulære rum i biofilmen. Her ratiometrisk farvestof, seminaphthorhodafluor-4F 5- (and-6) carboxylsyre (C-snarf-4) anvendes til at overvåge ekstracellulær pH i in vivo dyrket dental biofilm i sammensætningen ukendt art. Ved udsættelse for glucose farvestoffet er op-koncentreret inde alle bakterieceller i biofilm; det anvendes således både som en universel bakteriel plet og som en markør af ekstracellulært pH. Efter konfokal mikroskopisk billede erhvervelse, er den bakterielle biomasse fjernes fra alle billeder ved hjælp af digital billedanalyse software, som tillader udelukkende beregne ekstracellulær pH. pH ratiometry med ratiometrisk farvestof er velegnet til at studere ekstracellulær pH ​​i tynde biofilm på op til 75 um tykkelse, men er begrænset til pH-intervallet mellem 4,5 og 7,0.

Introduction

Den her beskrevne fremgangsmåde tillader overvågning ekstracellulære pH i dentale biofilm i intervallet mellem 4,5 og 7, ved hjælp af ratiometrisk farvestof seminaphthorhodafluor-4F 5- (and-6) carboxylsyre (C-snarf-4) i kombination med konfokal laser scanning mikroskopi og digital billedanalyse. Den anvendte fluorescerende farvestof er pH-følsom og viser et skift i sin fluorescerende emission afhængigt af tilstanden af ​​protonering. Den fluorescerende emission af de protonerede molekyle topper ved 580 nm og emission af deprotoneret molekyle ved 640 nm ^1. Forholdet mellem de fluorescerende emissionsintensiteter i to detektionsvinduer omfattende de to emissionstoppe (576 – 608 nm og 629-661 nm) afspejler således pH i den flydende fase, uanset koncentrationen farvestof. Med en _pKa på ~ 6.4 farvestoffet er egnet til at visualisere pH i moderat sure miljøer.

PH i bakterielle biofilm, er af central betydning for alle metaboliske processer.I tilfælde af dental biofilm, pH i den ekstracellulære matrix er nøglen virulensfaktor for udvikling af karies. Udvidede perioder med lav pH-værdi på biofilmen-tand interfaceledning at bremse demineralisering af den underliggende emalje ^2. På grund af den komplekse tredimensionale arkitektur af biofilm, metabolitter, herunder organiske syrer, er ikke ensartet fordelt hen over biofilmen. Meget og mindre syrefase mikromiljøer kan findes i tæt rumlig nærhed ^3.

I årtier blev lodrette pH-gradienter i biofilm indspillet med hjælp fra mikroelektroder ^4-6. Mens de tilbyder en god rumlig opløsning på grund af deres lille spids størrelse, er de ikke velegnede til at overvåge horisontale gradienter. Endvidere indsættelse af elektroden forstyrrer biofilmen mekanisk. Kvantitative fluorescerende mikroskopiske teknikker har den fordel at visualisere pH-ændringer i forskellige områder af en biofilm uden mekanisk blandence. Forskellige mikroskopiske synsfelter kan vælges frit og filmede gentagne gange over længere perioder ^1,7-9. Men når fortolkningen mikroskopiske biofilm billeder, er det vigtigt at skelne mellem fluorescens hidrørende fra den mikrobielle biomasse og fluorescens stammer fra det ekstracellulære rum. Under sure betingelser, pH inde bakterieceller er forskellig fra pH i den ekstracellulære matrix, som bakterierne aktivt transportere protoner tværs deres cellemembran på bekostning af adenosintriphosphat ^10. I forbindelse med caries, er intracellulær bakterie pH ikke har en direkte indvirkning på de underliggende emalje mens lav ekstracellulære pH fører til demineralisering. Gennemsnit pH i mikroskopiske billeder, der indeholder både bakterier-frie områder og bakterier fører til fejlagtige resultater. Anvendelse af andre pletter sammen med det pH-følsomme farvestof for at visualisere den bakterielle biomasse og skelne mellem ekstra- og intracellulære områder bringer abud risikoen for fluorescerende forurening af det ekstracellulære rum og falske målinger ^11.

Den foreliggende manuskript beskriver derfor anvendelsen af ​​den ratiometriske farvestof i en dobbelt funktion; både som pH markør og som en universel bakteriel plet. Som farvestoffet er op-koncentreret i bakterieceller er kombinationen af ​​konfokal mikroskopiske billeddannelse og en præcis billedanalyse procedure digital tillader bestemmelse af ekstracellulær pH ​​i området mellem 4,5 og 7,0 i tynde dental biofilm.

Protocol

Den eksperimentelle protokol blev gennemgået og godkendt af den etiske komité i Århus Amt (M-20.100.032). 1. Konfokal Mikroskopisk Kalibrering af Ratiometrisk Dye For erhvervelse billede, bruge en omvendt konfokal mikroskop udstyret med en inkubator, en 63X / 1.2-numerisk blænde vand nedsænkning mål, en 543 nm laser linje og en META detektor. Forbered HEPES buffer stamopløsninger (50 mM, justeret til pH 4,5 til 8,5 i trin af 0,1 pH-enheder). Tilsæt 100 pi af hver opløsning i brønde…

Representative Results

I denne procedure tillader overvågning ekstracellulære pH falder i forskellige mikromiljøer af tand biofilm i pH-området fra 4,5 til 7 i realtid. Hvis der vælges de eksperimentelle betingelser som beskrevet ovenfor, pH begynder at falde inden for alle områder af biofilm kort efter udsættelse for glucose. Når pH i en biofilm dråber, bakterieceller bliver synlige inden for kort tid (<1 min), som den ratiometrisk farv…

Discussion

Mikroskopiske overvågning af biofilm pH tilvejebringer adskillige fordele i sammenligning med elektrodematerialer eller mikroelektrode målinger ^4-6. Mikroskopiske teknikker tillader at bestemme pH med en høj rumlig opløsning og tillade opfange både horisontale og vertikale pH-gradienter i biofilm uden at forstyrre biofilmen mekanisk. Tidligere forsøg på mikroskopisk pH overvågning, imidlertid ikke skelne mellem ekstracellulær og intracellulær pH i biofilm ^1,7,9. På grund af bakteriel hom…

Materials

Zeiss LSM 510 META	Zeiss	N/A
C-Apochromat 63X water immersion objective	Zeiss	N/A
XL Incubator	PeCON	N/A
SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid	Life Technologies	S23920
Dimethyl sulfoxide	Life Technologies	D12345
HEPES	Life Technologies	11344-041
Costar 96-well black clear-bottom plate	Fisher Scientific	07-200-567
Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit)	Menzel	N/A
Alginate impression material	GC Corporation	N/A
Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs	Axis Dental	LS-906
Orthodontic retainer containers	Spark Medical Equipment Co., Ltd	SK-WDTC01
Sticky wax	Dentsply	N/A
Chewing paraffin wax	Ivoclar Vivadent AG	N/A
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	D0632	Used during preparation of salivary solution
0.45 µm and 0.2 µm syringe filters	Sigma Aldrich	CLS431220; CLS431219
daime	University of Vienna, Austria	http://dome.csb.univie.ac.at/daime
ImageJ	NIH, Bethesda, Maryland, USA	http://imagej.nih.gov/ij/