The Complete och uppdaterad "Rotifer polyculture Method" för uppfödning första matningsZebraFish
Summary
Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This “polyculture” strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.
Abstract
The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an “on-demand”, nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) är en framstående försöksdjurs används i ett växande antal vetenskapliga discipliner, inklusive, men inte begränsat till utvecklingsgenetik, toxikologi, beteende, vattenbruk, regenerativ biologi och modellering av många mänskliga sjukdomar 1 – 5. Även arten är relativt lätt att underhålla i laboratoriet, det finns ett antal utmaningar för ledningen som är förknippade med deras kultur 6. Den mest framträdande av dessa är larv uppfödning, särskilt när fisken börjar först att mata efter gas blåsan inflationen 7. Under normala, kontrollerade förhållanden, denna utvecklings händelse inträffar på ~ 5 dagar efter befruktningen (DPF), med följande 3 – 5 dagars tillväxt är särskilt kritisk 7. Den centrala tekniska svårigheter under detta skede är att på ett adekvat möta näringsbehov i den första matnings larver – foder objekt måste vara lämplig storlek, Digesliga, attraktiv och tillgänglig på en nästan kontinuerlig basis, utan att skapa alltför avfall i odlingstankar. Historiskt har detta uppnåtts typiskt genom att leverera ett stort antal små mängder av foder för fisken i tankar, tillsammans med rutinvattenutbyte 8,9. Även om dessa metoder är till viss del framgångsrika, de är ineffektiva, kräver hög arbetsinsats, och åter enda variabel och begränsade tillväxttakt och överlevnad 10.
I naturen, zebrafisk larver förmodligen äter rikligt små djurplankton som finns i vattenmassan 11. Av denna anledning, larviculture protokoll som innehåller live-flöden såsom Paramecium, hjuldjur och Artemia är oftast mest effektiva 7. Under 2010, bäst och medförfattare visade att det var möjligt att odla larver zebrafisk i statisk, bräckt vatten tillsammans med saltvatten hjuldjur för de första 5 dagarna av exogen utfodring 12. Detta tillvägagångssätt, som utnyttjaes naturliga hög produktivitet av hjuldjur kulturer för att ge gott, mycket näringsrik byte utan att förorena vattnet, ger mycket höga hastigheter av larv tillväxt och överlevnad med låg arbetsinsats 12,13. Under de senaste åren har ett ökande antal laboratorier runt om i världen antog varianter av detta protokoll, och många är nu odling hjuldjur på ett kontinuerligt sätt för att stödja förskolor system 14.
Under de senaste åren har metoder för både hjuldjur / zebrafisk polyculture och rotifer produktion förfinats och förbättrats för att bli mer standardiserade och lätt skalbar. Den här artikeln innehåller steg-för-steg-instruktioner för 1) kontinuerlig och robust rotifer produktion och 2) inrättandet av hjuldjur / zebrafisk polyculture system som används för att stödja en stark tillväxt av fisk under de första 5 dagarna av exogen utfodring.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett framgångsrikt genomförande av hjuldjur polyculture metoden för att mata tidigt larver zebrafisk kräver effektiva protokoll för två uppgifter: att inrätta och upprätthålla en kontinuerlig rotifer kultursystem för att mata fiskarna och odling första utfodring zebrafisk larver tillsammans med hjuldjur i samma tank.
Inställningarna för en kontinuerlig saltvatten rotifer produktionssystem för zebrafisk laboratorier först beskrivits av Lawrence och medförfattare 14 h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vården och användning av fisk som genereras för representativa resultat som beskrivs i detta protokoll utfördes i full överensstämmelse med de riktlinjer som anges av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Boston Barnsjukhus, protokoll # 14-05-2673R.
Materials
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 Liter Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/h (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
- Ribas, L., & Piferrer, F. The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research. Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., & Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics : TIG. 29, 611-20 (2013).
- Santoriello, C., & Zon, L. I. Hooked! modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., & Witters, H. E. Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds. Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Harper, C., & Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference). CRC Press (2010).
- Nusslein-Volhard, C., & Dahm, R. Zebrafish, A Practical Approach. Oxford University Press (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. University of Oregon Press (2007).
- Carvalho, P., & Arau, L. Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance. Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., & Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).
- Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., & Lawrence, C. A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis). Zebrafish. 7 (3) 289-295 (2010).
- Lawrence, C. Advances in zebrafish husbandry and management. Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).
- Lawrence, C., Sanders, E., & Henry, E. Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish. Zebrafish. 9, 140-6 (2012).
- Tucker, C. S., & Hargreaves, J. A. Biology and Culture of Channel Catfish. 34, 634-657 (2004).
