בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע
Summary
This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.
Abstract
Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.
Introduction
בעיות עור הנעים בין דלקת עור ממגע, אקזמה, פסוריאזיס, צלוליטיס, זיהומים פטרייתיים ומורסות לסרטן העור שאינו מלנום נמצאו להיות בין 50 המחלות הנפוצות ביותר בעולם, והסיבה הרביעית המובילה העולמית של מחלות שאינן קטלניות בשנת 2010 1. בהתאם לכך, החקירה של מנגנונים מולקולריים ותאיים שבבסיס מחלות עור שונים הוא אזור חיוני ופעיל של מחקר. מודלים של מכרסמים היו להפליא שימושיים בהבנה של מצבי עור דלקתיים כגון אטופיק דרמטיטיס 2, 3 פסוריאזיס, או זיהום Staphylococcus aureus 4. פרוטוקולים זולים, יעילים, ופשוט לעיכול אנזימטי של רקמת עור עכבר יכולים לספק הכנות של תאים שיכולים לשמש למגוון רחב של יישומים במורד הזרם להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות עור טוב יותר. הנה, שיטה פשוטה וחסכונית מתוארת להאנזימטית תקציר של עור עכבררקמה ובידוד של לויקוציטים הסתננות עור שיכול לשמש לתרבית תאים, in vivo העברת מאמצת, ניתוח תזרים cytometric ומיון או מחקרי ביטוי גנים. המטרה הכללית של הליך זה היא להכין השעיה תא בודדת של כדוריות דם לבנות-הסתננות עור עם כדאיות תא גבוהות תוך מזעור עלויות הקשורות בדרך ערכות מגיב מותאם אישית וdissociators המכני.
שיטות ניתוק רקמת עור קיימות 05-07 מאי לגרום לשלמות סמן כדאיות תא ומשטח נמוכה, או לדרוש ערכות אנזים מותאמות אישית ומכונות דיסוציאציה הרקמה יקרה 8-11. בעוד העיכול של רקמת עור אוזן עכבר הוא נפוץ למדי 12-13, לעכל רקמת עור keratinized מאוד (למשל מהאגף) יכול לגרום להכנות תא מזוהמות בכמויות גדולות של פסולת בלתי תאית. במחקר שנערך לאחרונה, זייד ועמיתים מתעכלים עור אגף עכבר על 90 דקות ב2.5 מ"ג / מיליליטר dispase, folloנישא ב -45 דק 'ב 3 מ"ג collagenase / מיליליטר 7. במחקר אחר, חוקרים אלה משמשים incubations מרובה עם עיכול שילוב של 2.5 שעות, כוללים השימוש בטריפסין / EDTA, collagenase III, וdispase 5. השימוש בטריפסין אינו מומלץ לעיכול עור האנזימטית, כטיפול עם טריפסין מיצרנים שונים הוכח להשפיע מדידה השלמות של חלבונים בתא שטח בתאי יונקים 14-15. בנוסף, dispase יכולה להיות השפעה משמעותית על יכולות שגשוג של תאי CD4 וCD8α T ולהשפיע שפע פני השטח של לפחות 20 מולקולות, כולל סמני הפעלת תא T הנפוץ כגון CD62L 16. פרוטוקולים אחרים משתמשים RPMI 1640 במדיום העיכול 6. עם זאת, הנוכחות של Mg 2 + Ca 2 + בRPMI יכולה לגרום לתא נרחב צבירה 17.
פרוטוקול אידיאלי לניתוק רקמה צריך לשאוף לכדאיויות תא גבוהות, נמוכותהרמות של צבירת תא, ונזק מינימאלי לתא חלבוני פני השטח. הכנות תא סטרומה הבלוטה לימפה באיכות גבוהה שהושגו עם פרוטוקולים המשתמשים incubations אנזים קצר יותר, 2 + תקשורת חופשית Ca 2 + וMg, ולהימנע מטריפסין וdispase 18. עם זאת, פרוטוקולים מסוג זה לא נקבעו לניתוק של עור עכבר כולו.
כאן, פרוטוקול מתואר לנתק, לבודד, ולהעשיר את כדוריות דם לבנות-הסתננות עור מעור אגף עכבר-תיגר אלרגן. בקצרה, עור נכרת הוא-מודגרות מראש במאוזן מלח הפתרון של האנק (HBSS) עם 10% בסרום שור עוברי עבור שעה 1 כדי לרכך את הרקמה לעיכול ולהסיר את כל רקמת עור או שומן עודף מת. זה ואחריו צעד עיכול אנזימטי 30 דקות עם 0.7 מ"ג / מ"ל collagenase ד Collagenase D יש השפעות מינימליות על צפיפות של סמנים פני תא, ואין כל השפעה על התפשטות תאי T במבחנה 16,18, שהופך אותומתאים מאוד ליישומים הכוללים אפיון של חלבוני פני השטח. בעקבות עיכול אנזימטי, צנטריפוגה שיפוע צפיפות רציפה הייתה משמשת להסרת תאי אפיתל ופסולת מהשעית התא הבודד ולהעשיר לתאי hematopoietic. חשוב לציין, בהליך זה ימנע ריאגנטים יקרים מבוסס עמודת תא מגנטי הפרדה וניתוק מכונות רקמה 8-11, וניתן לבצע עם ציוד וחומרים הנמצא במעבדת מחקר ביו-רפואית בסיסית. הנה פרוטוקול זה שימש כדי לבודד לויקוציטים מעור אגף פעמים תיגר שלוש עם oxazolone hapten (השור) בעכברי ND4 השוויצריים רגישים בעבר (המותאם מ 19). תאים נותחו באמצעות cytometry זרימה רב-פרמטרית. טכניקה זו הניבה השעיה תא עם מינימאלית פסולת ו> כדאיות 95% של לימפוציטים המבודד שנותחו על ידי זרימה רבת-פרמטרית cytometry למדוד את החדירה של לימפוציטים מסוג T ונויטרופילים לsk המושפעב.
Protocol
Representative Results
Discussion
אפיון שינויים בכדוריות דם לבנות עור-תושב במודלים של מכרסמים של מחלות עור כגון אטופיק דרמטיטיס או פסוריאזיס הוא חשוב להבנת קשרים בין מכניסטית זרם תא הדלקתי ופתולוגיה מחלה. כאן אנו מתארים טכניקה חסכונית לבודד את כדוריות דם לבנות מרקמת עור עם ציוד בסיסי שנמצא ברוב מעבד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המכונים הלאומי לבריאות (NIH R15 NS067536-01A1 לDC), הלאומי וולוודיניה אגודה (הפרס לDC), ומקאליסטר המכללה תמכו ביצירה זו. CB קיבל מלגה מהתכנית בקמן חוקרי מקאליסטר המכללה, ממומנת על ידי ארנולד ומייבל בקמן הקרן. BTF וTM נתמכים על ידי JDRF 2-2011-662. אנו מודים לד"ר ג'ייסון Schenkel וד"ר יוליאנה לואיס לייעוץ טכני, וכל החברים הנוכחיים ולשעבר המעבדה Chatterjea לעזרה והתמיכה שלהם.
Materials
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3e-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8a-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
References
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., & Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
- Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., & Elder, J. T. Mouse models of psoriasis. J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., & DeLeo, F. R. Mouse Models of Innate Immunity. Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).
- Mackay, L. K. et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
- Schaerli, P. et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
- Zaid, A. et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-12 (2014).
- Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., & Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., & Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
- Nagao, K. et al.Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., & Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Dudeck, A. et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-84 (2011).
- Hershko, A. Y. et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
- Huang, H.-L. et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, 36 (2010).
- Tabatabaei, M. et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., & Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Gu, D., Fan, Q., & Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp.(78), e50311 (2013).
- Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., & Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp.(90), e51803 (2014).
- Martinov, T. et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673 (2013).
- Katsares, V. et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
- Thomas, M. L., & Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
- Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., & Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).
