Isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica Digest e Separazione Gradient
Summary
This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.
Abstract
Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.
Introduction
Le condizioni della pelle che vanno da dermatite da contatto, eczema, psoriasi, cellulite, infezioni fungine e ascessi a tumori cutanei non-melanoma sono risultati essere tra le 50 malattie più diffuse a livello mondiale, e la quarta causa globale di malattie non mortali nel 2010 1. Di conseguenza, l'indagine dei meccanismi molecolari e cellulari alla base diverse patologie della pelle è una zona necessaria e attiva di ricerca. Modelli di roditori sono stati notevolmente utili per la comprensione delle condizioni infiammatorie della pelle come la dermatite atopica 2, 3 psoriasi, o infezione da Staphylococcus aureus 4. Protocolli economici, efficienti e semplici per la digestione enzimatica del tessuto cutaneo mouse può fornire preparazioni di cellule che possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni a valle per comprendere meglio la fisiopatologia di malattie della pelle. Qui, un metodo semplice ed economico è descritto per digerito enzimatico di pelle topotessuto e l'isolamento di leucociti infiltranti pelle che può essere utilizzato per la coltura cellulare, in vivo trasferimento adottivo, analisi citofluorimetrica e smistamento o studi di espressione genica. L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare una sospensione singola cella di leucociti-pelle infiltrante con la vitalità delle cellule di alta minimizzando i costi tipicamente associati con kit di reagenti personalizzate e dissociatori meccanici.
Esistenti tessuto cutaneo metodi di dissociazione 5-7 può provocare vitalità delle cellule e la superficie di integrità basso marcatore, o richiedere i kit di enzimi personalizzate e costose macchine di dissociazione dei tessuti 8-11. Mentre la digestione del tessuto cutaneo orecchio del mouse è ragionevolmente diffusa 12-13, digerire il tessuto della pelle altamente cheratinizzato (ad esempio, dal fianco) può risultare in preparazioni di cellule contaminate con grandi quantità di detriti non cellulare. In un recente studio, Zaid e colleghi hanno digerito la pelle del fianco del mouse per 90 minuti a 2,5 mg / ml dispasi, follocon a capo 45 min a 3 mg / ml di collagenasi 7. In un altro studio, questi ricercatori hanno utilizzato più incubazioni con una digestione combinato di 2,5 ore, compreso l'uso di tripsina / EDTA, collagenasi III, e dispasi 5. L'uso di tripsina non è raccomandato per la digestione enzimatica della pelle, come il trattamento con tripsina da diversi costruttori ha mostrato di influenzare misurabile l'integrità delle proteine di superficie cellulare su cellule di mammifero 14-15. Inoltre, dispasi può avere effetti significativi sulla capacità proliferativa delle cellule CD4 e CD8α T e influenzare l'abbondanza superficie di almeno 20 molecole, tra cui comune T marcatori di attivazione delle cellule, quali CD62L 16. Altri protocolli utilizzano RPMI 1640 nel mezzo di digestione 6. Tuttavia, la presenza di Mg 2+ e Ca 2+ in RPMI può causare aggregazione vasta cella 17.
Un protocollo ideale per la dissociazione di tessuto dovrebbe puntare per la vitalità delle cellule in alto, bassolivelli di aggregazione delle cellule, e il minimo danno al cellulare proteine di superficie. Alta qualità preparazioni cellulari linfonodo stromali sono stati compiuti con protocolli che utilizzano enzimi incubazione più brevi, Ca 2+ e Mg 2+ media liberi, e di evitare tripsina e dispasi 18. Tuttavia, non sono state stabilite protocolli di questo tipo per la dissociazione di tutta la pelle del mouse.
Qui, un protocollo è descritto a dissociarsi, isolare, e arricchire leucociti-pelle infiltrazione dalla pelle del mouse fianco allergene-sfidati. In breve, la pelle asportata è pre-incubato in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con siero fetale bovino 10% per 1 ora per ammorbidire i tessuti per la digestione e rimuovere il tessuto adiposo della pelle o morti in eccesso. Questa è seguita da una fase 30 min di digestione enzimatica con 0,7 mg / ml di collagenasi D. collagenasi D ha effetti minimi sulla densità di marcatori di superficie cellulare, e nessun effetto sulla proliferazione delle cellule T in vitro 16,18, rendendoparticolarmente adatto per applicazioni che coinvolgono la caratterizzazione delle proteine di superficie. A seguito di digestione enzimatica, discontinua gradiente di densità centrifugazione è stato utilizzato per rimuovere le cellule epiteliali e detriti dalla cella singola sospensione e arricchire per le cellule ematopoietiche. È importante sottolineare che questo procedimento evita costosi cellulari magnetico reagenti separazione basati su colonne e macchine dissociazione tissutale 8-11, e può essere eseguita con attrezzature e materiali trovati in un laboratorio di base ricerca biomedica. Ecco questo protocollo è stato utilizzato per isolare leucociti dalla pelle fianco sfidato tre volte con il oxazolone aptene (bue) in precedenza sensibilizzati topi ND4 svizzeri (adattato da 19). Le cellule sono state analizzate utilizzando citometria a flusso multiparametrica. Questa tecnica ha prodotto una sospensione cellulare con detriti minima e> 95% vitalità dei linfociti isolati che sono state analizzate mediante flusso multi-parametrica citometria a misurare l'infiltrazione di linfociti T e neutrofili nella sk interessatoin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Caratterizzare cambiamenti nei leucociti pelle-residenti in modelli di roditori di malattie della pelle come la dermatite atopica o psoriasi è importante per capire i collegamenti meccanicistici tra afflusso di cellule infiammatorie e la patologia della malattia. Qui si descrive una tecnica economica per isolare leucociti dal tessuto della pelle con attrezzature di base trova nella maggior parte dei laboratori di ricerca biomedica. Questa tecnica relativamente rapida evita l'uso di macchine dissociazione tissue cos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 a DC), la National Association Vulvodinia (premio a DC), e Macalester College di sostenuto questo lavoro. CB ha ricevuto una borsa di studio dalla Macalester College di Beckman Scholars Program, finanziato dal Arnold e Mabel Beckman Foundation. BTF e TM sono supportati da JDRF 2-2011-662. Ringraziamo il Dr. Jason Schenkel e il Dr. Giuliana Lewis per un parere tecnico, e tutti i membri attuali e precedenti del laboratorio Chatterjea per il loro aiuto e sostegno.
Materials
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3e-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8a-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
References
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