Questo protocollo descrive la digestione enzimatica della pelle di topo in un terreno ricco di sostanze nutritive seguita dalla separazione in gradiente per isolare i leucociti. Le celle così derivate possono essere utilizzate per diverse applicazioni a valle. Si tratta di un'alternativa efficace, economica e migliorata alle macchine per la dissociazione dei tessuti e ai protocolli di digestione dei tessuti più aggressivi basati su tripsina e dispasi.
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Articolo metodologico
Isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica Digest e Separazione Gradient
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dissociare la pelle murina in una sospensione a singola cellula è essenziale per l'analisi cellulare a valle, come la caratterizzazione delle cellule immunitarie infiltranti in modelli di infiammazione cutanea di roditori. Qui, descriviamo un protocollo per la digestione della pelle di topo in una soluzione ricca di sostanze nutritive con collagenasi D, seguita dalla separazione delle cellule ematopoietiche utilizzando un gradiente di densità discontinuo. Le cellule così ottenute possono essere utilizzate per studi in vitro, trasferimento in vivo e altre analisi cellulari e molecolari a valle, compresa la citometria a flusso. Questo protocollo è un'alternativa efficace ed economica ai costosi dissociatori meccanici, alle colonne di separazione specializzate e ai metodi di digestione più severi basati su tripsina e dispasi, che possono compromettere la vitalità cellulare o la densità delle proteine di superficie rilevanti per la caratterizzazione fenotipica o la funzione cellulare. Come mostrato qui nei nostri dati rappresentativi, questo protocollo ha prodotto cellule altamente vitali, conteneva sottogruppi di cellule immunitarie specifiche e non ha avuto alcun effetto sull'integrità delle comuni proteine marcatrici di superficie utilizzate nell'analisi citofluorimetrica.
Introduzione
Le condizioni della pelle che vanno da dermatite da contatto, eczema, psoriasi, cellulite, infezioni fungine e ascessi a tumori cutanei non-melanoma sono risultati essere tra le 50 malattie più diffuse a livello mondiale, e la quarta causa globale di malattie non mortali nel 2010 1. Di conseguenza, l'indagine dei meccanismi molecolari e cellulari alla base diverse patologie della pelle è una zona necessaria e attiva di ricerca. Modelli di roditori sono stati notevolmente utili per la comprensione delle condizioni infiammatorie della pelle come la dermatite atopica 2, 3 psoriasi, o infezione da Staphylococcus aureus 4....
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Protocollo
Nota: i topi 8-12 settimane vecchia femmina ND4 svizzero Webster, convenzionalmente sono alloggiati con libero accesso a cibo e acqua, sono stati utilizzati per questi studi Il protocollo sperimentale utilizzato (B13S1) è stato approvato dal IACUC del Macalester College..
1. Sensibilizzazione e sfida con Oxazolone
- Giorno 0
- Preparare camera di anestesia con l'aggiunta di 3 ml di isoflurano per asciugamani assorbenti posizionati sotto rete in fondo a un 4 L con coperchio vaso di vetro. Per i topi ND4 femminile usato qui, il tempo nella camera è 30-60 secondi fino a quando il soggetto è adeguatamente anestetizzato; ottimizzare la....
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Risultati
Collagenasi D trattata splenociti presentano livelli simili di CD4 e CD8 α sulle cellule T rispetto ai controlli multimediali trattati
In primo luogo, gli effetti potenziali di collagenasi D sulla frequenza e la superficie abbondanza di lignaggio e di attivazione marcatori su sottogruppi di cellule T sono stati valutati utilizzando tessuto linfoide secondario come controllo. Una sospensione di splenociti ottenuti da topi è stato N.......
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Discussione
Caratterizzare cambiamenti nei leucociti pelle-residenti in modelli di roditori di malattie della pelle come la dermatite atopica o psoriasi è importante per capire i collegamenti meccanicistici tra afflusso di cellule infiammatorie e la patologia della malattia. Qui si descrive una tecnica economica per isolare leucociti dal tessuto della pelle con attrezzature di base trova nella maggior parte dei laboratori di ricerca biomedica. Questa tecnica relativamente rapida evita l'uso di macchine dissociazione tissue cost.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari o di altro da dichiarare.
Ringraziamenti
Il National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 a DC), la National Association Vulvodinia (premio a DC), e Macalester College di sostenuto questo lavoro. CB ha ricevuto una borsa di studio dalla Macalester College di Beckman Scholars Program, finanziato dal Arnold e Mabel Beckman Foundation. BTF e TM sono supportati da JDRF 2-2011-662. Ringraziamo il Dr. Jason Schenkel e il Dr. Giuliana Lewis per un parere tecnico, e tutti i membri attuali e precedenti del laboratorio Chatterjea per il loro aiuto e sostegno.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| HBSS con rosso fenolo, senza calcio, senza magnesio, liquido | Sigma Aldrich | 55021C | Conservare sterile fino al giorno dell'uso. |
| HEPES, ≥ 99,5% (titolazione) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Soluzione di sale disodico EDTA | Sigma Aldrich | E7889 | Conservare sterile fino al giorno dell'uso. |
| Siero fetale bovino, USDA, inattivato al calore, Premium Select | MidSci | S01520HI | Conservare sterile fino al giorno dell'utilizzo. |
| Percoll, pH 8,5-9,5 (25° C) | Sigma Aldrich | P1644 | Mantenere sterile. Prima dell'uso, il Percoll deve essere reso isotonico con 10X PBS sterile. |
| Kit combinato per rifinitore | Kent Scientific | CL9990-1201 | Usa il rifinitore più grande per radere il fianco e la schiena. |
| 4-etossimetilene-2-fenil-2-ossazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | si scioglie in 100% EtOH a 50 gradi; C per 15 minuti su un piatto rotante. |
| Anti-topo purificato CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Anticorpo utilizzato per bloccare il legame anticorpale non specifico durante la colorazione degli anticorpi per citometria a flusso |
| anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per la citometria a flusso |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per il flusso citometria |
| anti-CD8&alfa;-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Anticorpo utilizzato per colorare le cellule per citometria a flusso |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Colorante di vitalità per citometria a flusso |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | Analizzatore cellulare N/A | (18 parametri) |
| Collagenasi D da Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot enzima liofilizzato a 5 mg/ml in HBSS con rosso fenolo, senza calcio e senza magnesio in aliquote da 1 ml. Conservare immediatamente a -20 gradi C per un massimo di sei mesi. |
| ND4 Topi femmina svizzeri | Harlan | 0-32 | 8-12 settimane; alloggiati convenzionalmente con libero accesso a cibo e acqua e utilizzati secondo le linee guida IACUC del Macalester College. |
Riferimenti
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K.
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