एंजाइमी डाइजेस्ट और ढाल जुदाई का उपयोग माउस त्वचा से घुसपैठ कर Leukocytes का अलगाव
Summary
This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.
Abstract
Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.
Introduction
संपर्क जिल्द की सूजन, एक्जिमा, सोरायसिस, cellulitis, गैर मेलेनोमा त्वचा कैंसर के लिए फंगल संक्रमण और फोड़े से लेकर त्वचा की स्थिति दुनिया भर में 50 सबसे अधिक प्रचलित रोगों के बीच में होना पाया गया है, और 2010 1 में गैर-घातक रोगों का चौथा प्रमुख वैश्विक कारण। तदनुसार, विविध त्वचा विकृतियों अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र की जांच के अनुसंधान का एक जरूरी और सक्रिय क्षेत्र है। कृंतक मॉडल ऐसे atopic जिल्द की सूजन 2, सोरायसिस 3, या स्ताफ्य्लोकोच्चुस संक्रमण 4 के रूप में भड़काऊ त्वचा की स्थिति की समझ में उल्लेखनीय उपयोगी किया गया है। माउस त्वचा के ऊतकों के enzymatic पाचन के लिए सस्ती, कुशल, और सरल प्रोटोकॉल बेहतर त्वचा रोगों के pathophysiology को समझने के बहाव के अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कोशिकाओं की तैयारी प्रदान कर सकते हैं। इधर, एक सरल और किफायती तरीका माउस त्वचा के enzymatic पचाने के लिए वर्णित हैऊतक और सेल संस्कृति, इन विवो दत्तक हस्तांतरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि त्वचा में घुसपैठ leukocytes के अलगाव, cytometric विश्लेषण और छँटाई या जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के प्रवाह। इस प्रक्रिया के समग्र लक्ष्य आम तौर पर कस्टम अभिकर्मक किट और यांत्रिक dissociators के साथ जुड़े लागत को कम करते हुए उच्च सेल व्यवहार्यता के साथ त्वचा में घुसपैठ leukocytes के एक एकल कक्ष निलंबन को तैयार है।
मौजूदा त्वचा ऊतक हदबंदी तरीकों 5-7 कम सेल व्यवहार्यता और सतह मार्कर अखंडता में परिणाम है, या कस्टम एंजाइम किट और महंगा ऊतक हदबंदी मशीनों 8-11 आवश्यकता हो सकती है। माउस कान त्वचा के ऊतकों के पाचन यथोचित, 12-13 प्रचलित अत्यधिक keratinized त्वचा के ऊतकों को पचाने है (उदाहरण के पार्श्व से) गैर सेलुलर मलबे की बड़ी मात्रा के साथ दूषित सेल तैयारी में परिणाम कर सकते हैं। हाल के एक अध्ययन में, हमदानी और उनके सहयोगियों 2.5 मिलीग्राम में 90 मिनट के लिए माउस पार्श्व त्वचा पचा / एमएल Dispase, follo3 मिलीग्राम / एमएल कोलैजिनेज़ 7 में 45 मिनट से शादी की। एक अन्य अध्ययन में इन शोधकर्ताओं / trypsin EDTA, कोलैजिनेज़ III के उपयोग सहित, 2.5 घंटे की एक संयुक्त पाचन के साथ कई incubations के लिए प्रयोग किया जाता है, और 5 dispase। विभिन्न निर्माताओं से trypsin के साथ उपचार हद स्तनधारी कोशिकाओं पर 14-15 कोशिका की सतह प्रोटीन की अखंडता को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है के रूप में trypsin के उपयोग, एंजाइमी त्वचा पाचन के लिए सिफारिश नहीं है। इसके अतिरिक्त, Dispase CD4 और CD8α टी कोशिकाओं के proliferative क्षमताओं पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है और इस तरह के CD62L 16 के रूप में आम टी सेल सक्रियण मार्कर सहित कम से कम 20 अणुओं की सतह बहुतायत प्रभावित करते हैं। अन्य प्रोटोकॉल पाचन मध्यम 6 में 1640 RPMI का उपयोग करें। हालांकि, RPMI में 2 मिलीग्राम + और सीए 2 की उपस्थिति व्यापक सेल एकत्रीकरण 17 का कारण बन सकता है।
ऊतक हदबंदी के लिए एक आदर्श प्रोटोकॉल उच्च सेल व्यवहार्यता, कम करने के लिए उद्देश्य होना चाहिएसेल एकत्रीकरण, और कम से कम नुकसान के स्तर को सतह प्रोटीन सेल। उच्च गुणवत्ता लिम्फ नोड stromal सेल की तैयारी में कम एंजाइम incubations, सीए 2 और 2 मिलीग्राम + स्वतंत्र मीडिया का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल के साथ पूरा किया, और trypsin बचने के लिए और 18 dispase कर दिया गया है। हालांकि, इस प्रकार के प्रोटोकॉल पूरे माउस त्वचा की हदबंदी के लिए स्थापित किया गया है।
इधर, एक प्रोटोकॉल, अलग कर देना अलग, और allergen को चुनौती दी माउस पार्श्व त्वचा से त्वचा में घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स बेहतर बनाने के लिए वर्णित है। संक्षेप में, excised त्वचा पाचन के लिए ऊतक नरम और किसी भी अतिरिक्त मृत त्वचा या वसा ऊतकों को दूर करने के लिए 1 घंटे के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HBSS) में पूर्व incubated है। यह 0.7 मिलीग्राम के साथ एक 30 मिनट enzymatic पाचन कदम से पीछा किया जाता है / एमएल कोलैजिनेज़ डी कोलेजिनेस डी यह कर रही है, कम से कम कोशिका की सतह मार्करों के घनत्व पर प्रभाव, और इन विट्रो 16,18 में टी सेल प्रसार पर कोई प्रभाव नहीं हैसतह प्रोटीन के लक्षण वर्णन जुड़े अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक उपयुक्त है। Enzymatic पाचन के बाद, असंतत घनत्व ढाल centrifugation एकल कोशिका निलंबन से उपकला कोशिकाओं और मलबे को हटाने और hematopoietic कोशिकाओं के लिए बेहतर बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। महत्वपूर्ण बात, इस प्रक्रिया महंगा स्तंभ आधारित चुंबकीय सेल जुदाई अभिकर्मकों और ऊतक हदबंदी मशीनों 8-11 से बचा जाता है, और एक बुनियादी जैव चिकित्सा अनुसंधान प्रयोगशाला में पाया उपकरणों और सामग्री के साथ किया जा सकता है। यहाँ इस प्रोटोकॉल (19 से अनुकूलित) पहले से अवगत ND4 स्विस चूहों में hapten oxazolone (बैल) के साथ पार्श्व त्वचा से चुनौती दी तीन बार ल्यूकोसाइट्स को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रकोष्ठों बहु पैरामीट्रिक फ्लो का उपयोग विश्लेषण किया गया। इस तकनीक को न्यूनतम मलबे और cytometry प्रभावित एसके में टी lymphocytes और जीवाणुओं की घुसपैठ को मापने के लिए बहु-पैरामीट्रिक प्रवाह से विश्लेषण किया गया है, जो पृथक लिम्फोसाइटों के> 95% व्यवहार्यता के साथ एक सेल निलंबन झुकेंगेमें।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऐसे atopic जिल्द की सूजन या सोरायसिस के रूप में त्वचा रोगों के कृंतक मॉडल में त्वचा निवासी ल्यूकोसाइट्स में परिवर्तन निस्र्पक भड़काऊ सेल बाढ़ और रोग विकृति के बीच यंत्रवत कनेक्शन को समझने के लिए महत्वपूर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (डीसी के लिए एनआईएच R15 NS067536-01A1), राष्ट्रीय Vulvodynia एसोसिएशन (डीसी के लिए पुरस्कार), और Macalester कॉलेज इस काम का समर्थन किया। सीबी अर्नोल्ड और माबेल बैकमैन फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित Macalester कॉलेज बैकमैन विद्वान कार्यक्रम, से एक फैलोशिप प्राप्त किया। BTF और टीएम JDRF 2-2011-662 द्वारा समर्थित हैं। हम तकनीकी सलाह के लिए डॉ जेसन Schenkel और डॉ जुलियाना लुईस का शुक्र है, और उनकी मदद और समर्थन के लिए Chatterjea प्रयोगशाला के सभी वर्तमान और पूर्व सदस्य हैं।
Materials
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3e-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8a-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
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