Isolering av infiltrerande leukocyter från mus Skin Använda Enzymatisk Digest och Gradient Separation

Summary

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Abstract

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

Introduction

Hudåkommor som sträcker sig från kontakteksem, eksem, psoriasis, cellulit, svampinfektioner och bölder till icke-melanom hudcancer befanns vara bland de 50 vanligaste sjukdomarna i världen, och den fjärde ledande orsaken till icke-dödliga sjukdomar under 2010 ^1. Följaktligen är utredningen av molekylära och cellulära mekanismer som ligger bakom olika hud sjukdomar en nödvändig och aktivt forskningsområde. Gnagarmodeller har varit anmärkningsvärt användbar vid förståelsen av inflammatoriska hudtillstånd såsom atopisk dermatit ^2, psoriasis ^3, eller Staphylococcus aureus-infektion ^4. Inexpensive, effektiva och enkla protokoll för enzymatisk digerering av mus hudvävnad kan tillhandahålla beredningar av celler som kan användas för en mängd olika tillämpningar nedströms för att bättre förstå patofysiologin av hudsjukdomar. Här används en enkel och ekonomisk metod som beskrivits för enzymatisk uppslutning av mushudvävnad och isolering av huden infiltrerande leukocyter som kan användas för cellodling in vivo adoptiv överföring, flödescytometrisk analys och sortering eller gen expressionsstudier. Det övergripande målet med detta förfarande är att förbereda en enda cell suspension av hud-infiltrerande leukocyter med hög cellviabiliteten samtidigt minimera kostnaderna vanligtvis förknippas med anpassade reagenskit och mekaniska dissociators.

Befintliga hud vävnadsdissociering metoder ^5-7 kan leda till låg cellviabilitet och ytmarkör integritet, eller kräva anpassade enzymsatser och dyra vävnadsdissociering maskiner ^8-11. Även rötning av musöra hudvävnad är tämligen utbredd ^12-13, smälta mycket keratiniserad hudvävnad (t.ex. från flanken) kan resultera i cellpreparat kontaminerade med stora mängder av icke-cellulärt skräp. I en nyligen genomförd studie, Zaid och kollegor diger mus flank hud under 90 minuter i 2,5 mg / ml dispas, Followed med 45 minuter i 3 mg / ml kollagenas ^7. I en annan studie, dessa forskare använde flera inkubationer med en sammanlagd nedbrytning av 2,5 timmar, inklusive användning av trypsin / EDTA, kollagenas III, och dispas ^5. Användningen av trypsin rekommenderas inte för enzymatisk hud matsmältningen, såsom behandling med trypsin från olika tillverkare har visat att mätbart påverka integriteten för cellyteproteiner på däggdjursceller ^14-15. Dessutom kan dispas få betydande effekter på proliferativa förmåga CD4 och CD8a T-celler och påverka yta överflöd av minst 20 molekyler, inklusive gemensamma T-cellsaktivering markörer som CD62L ^16. Andra protokoll använder RPMI 1640 i matsmältningen mediet ^6. Emellertid kan närvaron av ^Mg2 + och ^Ca 2 + i RPMI orsaka omfattande cellaggregation ^17.

En idealisk protokoll för vävnadsdissociering bör sträva efter hög cellviabilitet, lågnivåer av cellaggregering och minimal skada på cellyteproteiner. Hög kvalitet preparat lymfkörtel stromacellinjer har åstadkommits med protokoll som använder kortare enzym inkubationer, ^Ca2 + och Mg ^{2 +} fria medier, och undvika trypsin och dispas ^18. Emellertid har protokoll av detta slag inte fastställts för dissociation av hela mushud.

Här är ett protokoll som beskrivits för att dissociera, isolera och berika hud-infiltrerande leukocyter från allergen-utmanade mus flank hud. I korthet, skars ut huden förinkuberades i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med 10% fetalt bovint serum under en timme för att mjuka vävnaden under matsmältningen och avlägsna eventuellt överskott död hud eller fettvävnad. Detta följs av en 30 minuters enzymatisk spjälkning steg med 0,7 mg / ml kollagenas D. kollagenas D har minimala effekter på tätheten av cellytmarkörer, och ingen effekt på T-cellsproliferation in vitro ^16,18, vilket gör detmycket lämplig för tillämpningar som innefattar karakterisering av ytproteiner. Efter enzymatisk digerering, blev diskontinuerlig densitetsgradientcentrifugering används för att avlägsna epitelceller och skräp från singel-cellsuspension och anrika hematopoietiska celler. Viktigt undviker detta förfarande dyra kolumnbaserad magnetisk cellseparation reagens och vävnadsdissociering maskiner ^8-11, och kan utföras med utrustning och material som finns i en grundläggande biomedicinsk forskningslaboratorium. Här detta protokoll användes för att isolera leukocyter från flank hud utmanade tre gånger med haptenet oxazolon (Ox) i tidigare sensibiliserade ND4 Swiss-möss (anpassad från 19). Celler analyserades med hjälp av multi-parametrisk flödescytometri. Denna teknik gav en cellsuspension med minimal skräp och> 95% viabilitet av isolerade lymfocyter som analyserades genom flera parametrisk flödescytometri för att mäta infiltration av T-lymfocyter och neutrofiler i den drabbade ski.

Protocol

Obs: 8-12 veckor gammal kvinna ND4 Swiss Webster-möss, konventionellt inrymda med fri tillgång till mat och vatten, användes för dessa studier Den experimentella protokoll som används (B13S1) godkändes av Macalester College IACUC.. 1. Sensibilisering och Challenge med oxazolon Dag 0 Förbered anestesi kammare genom tillsats 3 ml isofluran till absorberande handdukar placerade under mask på botten av en 4 L lock glasburk. För ND4 honmöss som används här, tid i kammaren är …

Representative Results

Kollagenas D behandlade splenocyter visar liknande nivåer av CD4 och CD8 α på T-celler i jämförelse med media behandlade kontroller Först var eventuella effekter av kollagenas D på frekvens och yta överflöd av härstamning och aktiveringsmarkörer på T-cellgrupper utvärderas med hjälp av sekundär lymfoidvävnad som en kontroll. En suspension av splenocyter erhölls från ND4 möss och tvättades under 1 timme med HBSS…

Discussion

Characterizing förändringar i huden hemmahörande leukocyter i gnagarmodeller av hudsjukdomar som atopisk dermatit eller psoriasis är viktigt för att förstå mekanistiska kopplingar mellan inflammatoriska celler tillströmning och sjukdomspatologin. Här beskriver vi en ekonomisk teknik för att isolera leukocyter från hudvävnad med basutrustning finns i de flesta biomedicinska forskningslaboratorier. Denna relativt snabb teknik undviker användningen av dyra vävnadsdissociering maskiner och anpassade rör och r…

Materials

HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid	Sigma Aldrich	55021C	Keep sterile until day of usage.
HEPES, ≥99.5% (titration)	Sigma Aldrich	H3375
EDTA disodium salt solution	Sigma Aldrich	E7889	Keep sterile until day of usage.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select	MidSci	S01520HI	Keep sterile until day of usage.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C)	Sigma Aldrich	P1644	Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.
Trimmer Combo Kit	Kent Scientific	CL9990-1201	Use the larger trimmer for shaving the flank and back.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one	Sigma Aldrich	E0753-10G	Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate.
Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2)	Tonbo Biosciences	70-0161	Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry
anti-CD3e-BV650 (145-2C11)	Becton Dickinson	564378	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)	eBioscience	47-0042-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD8a-BV785 (53-6.7)	BioLegend	100749	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)	eBioscience	48-0112-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11c-eFluor450 (N418)	eBioscience	48-0114-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD44-BV711 (IM7)	Becton Dickinson	563971	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11)	Tonbo Biosciences	35-0451-U025	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)	eBioscience	48-0452-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)	BioLegend	104431	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)	BioLegend	108407	Antibody used to stain cells for flow cytometry
Ghost Dye-BV510	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Viability dye for flow cytometry
LSR Fortessa	Becton Dickinson	N/A	Cell analyzer (18 parameters)
Collagenase D from Clostridium histolyticum	Roche Applied Science	11088858001	Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.  Store immediately at -20°C for up to six months.
ND4 Swiss female mice	Harlan	0-32	8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines.