ייצור מודרך זרימת דפוס בצפיפות גבוהה ברקוד נוגדן Microarray
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הייצור של בקנה מידה גדול, מערך ה- DNA או נוגדן דו ממדים מרובב, עם יישומים פוטנציאליים במחקרי איתות תא וזיהוי סמנים ביולוגיים.
Abstract
Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.
Introduction
microarrays הנוגדן היה בשימוש נרחב במחקרי proteomic במשך עשרות שנים כדי לבחון את נוכחותם של חלבונים ממוקדים, כוללים סמנים ביולוגיים חלבון 1-3. למרות שתחום זה ניצבת כיום בפני אתגרים גדולים מטכנולוגיות תפוקה גבוהה אחרות כגון ספקטרוסקופיית מסות (MS), יש עדיין הרבה מקום לשירות של microarrays נוגדנים, בעיקר משום שמכשירים אלה להרשות לעצמם נתונים לפרשנות פשוטה וממשק קל עם מבחני אחרים. בשנים האחרונות, שילוב של microarrays לפיגומי שבב סיפק microarray נוגדן הזדמנות חדשה לשגשג 4-7. לדוגמא, microarray ברקוד המשולב בשבב תא בודד בו נעשה שימוש במחקרי תקשורת סלולארי 8,9. טכנולוגיה זו יש יתרונות ייחודיים על פני טכנולוגיות microarray זמינות אחרות. הוא כולל אלמנטים במערך ב10-100 מיקרומטר, קטן בהרבה מהגודל הטיפוסי 150 מיקרומטר משמש בelemen microarray הקונבנציונליTS. הבנייה של אלמנטים במערך קטנים יותר מושגת באמצעות גישות זרימת דפוסים שיטתיות, וזה מעורר microarrays הקומפקטי שיכול לזהות חלבוני תא בודד מופרשים וחלבונים תאיים. יתרון נוסף הוא השימוש בהתקנה פשוטה, ללא מכשיר. הדבר חשוב במיוחד, משום שרוב המעבדות וחברות קטנות לא יכולים להיות מסוגלות לגשת למתקני גרעין microarray. microarrays הנוגדן ברקוד כגון תכונה משופרת תפוקת assay וניתן להשתמש בו כדי לבצע מבחני מרובבים מאוד על תאים בודדים תוך השגת רגישות גבוהה וספציפיות דומה לזו של assay immunosorbent כריך אנזים צמוד הקונבנציונלי (ELISA 8). טכנולוגיה זו מצאה יישומים רבים באיתור חלבונים מגליובלסטומה 9-11, תאי T 12, ומחזור התאים סרטניים 13. לחלופין, מערכי DNA ברקוד לבד כבר נוצלו במיקום המדויק של תאי עצב והאסטרוציטים ללחקותing ההרכבה vivo של רקמת מוח 14.
פרוטוקול זה מתמקד רק בשלבי הניסוי ולוקי הצטברות של microarray הנוגדן ברקוד דו-ממדי (2-D) שבה יש יישומים פוטנציאליים בזיהוי של סמנים ביולוגיים בדגימות fluidic ובתאים בודדים. הטכנולוגיה מבוססת על microarray דנ"א חד-גדילים, חד-ממדי (1-D) מיעון נבנה באמצעות oligonucleotides מאונך שהם בדוגמת מרחבית על מצעי זכוכית. דפוס 1-D נוצר כאשר זרימת ערוצים מקבילים המשמשים בשלב זרימת הדפוסים, ודפוס כזה מופיע כלהקות דיסקרטיות חזותי דומות ל1-D Universal Product Code (UPC) ברקודים. בניית מערך נוגדן 2-D (מ 'x n) – מזכירה קוד מטריקס 2-D מהיר התגובה (QR) – צריכה אסטרטגיות דפוסים מורכבות יותר, אך מאפשרת לקיבוע של נוגדנים בצפיפות גבוהה 8,15. הייצורדורש שני שלבי דפוסי DNA, עם הדפוס הראשון בניצב לשני. נקודות חיתוך של שני דפוסים אלה מהווים את המרכיבים מ 'x n של המערך. על ידי בחירה אסטרטגית הרצפים של DNA חד-גדילים (ssDNA) מנוצל בזרימת דפוסים, כל אלמנט במערך נתון מוקצה כתובת ספציפית. התייחסות מרחבית זה הכרחי בהבחנה בין אותות הקרינה בשקופית microarray. מערך ssDNA מומר מערך נוגדן דרך ההתאגדות של conjugates DNA-נוגדן המשלים, ויצר פלטפורמה שנקראת ספריית נוגדן בקידוד ה- DNA (DEAL 16).
פרוטוקול וידאו זה מתאר את השלבים העיקריים ביצירת מערכי nxm נוגדן הכוללים הכנת polydimethylsiloxane (PDMS) תבניות ברקוד, זרימת דפוסים ssDNA בשני כיוונים, הכנת conjugates DEAL הנוגדן-oligonucleotide, והמרת מערך 3 x 3 DNA ל3x 3 מערך נוגדנים.
Protocol
Representative Results
Discussion
עיצוב תבנית זרימה הוא השלב הקריטי הראשון בבודת microarray 2-D. כדי ליצור שני דפוסי DNA חופפים על מצע זכוכית, תכונות הערוץ של העיצוב הראשון צריכה להיות בניצב לאלה של (1A-B איור) השני. העיצובים בחשבון גם את היישומים במורד הזרם של microarray. במקרה של ניתוח תא בודד, microarray מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.
Materials
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see table below | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (0.50 mm diameter) | Electron Microscopy Sciences | 57393 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
References
- Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
- Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
- Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
- Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
- Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
- Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
- Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
- Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
- Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
- Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
- Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
- Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499 (2014).
- Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
- Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
- Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
- Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
- Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301 (2011).
