Strömungsmuster Guided Herstellung von High-Density-Barcode Antikörper Microarray
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines großflächigen, gemultiplexten zweidimensionalen DNA oder Antikörperarray, mit potentiellen Anwendungen in der Zellsignal Studien und Biomarkern.
Abstract
Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.
Introduction
Antikörper-Mikroarrays wurden weitgehend in der Proteomik seit Jahrzehnten verwendet, um die Anwesenheit von Zielproteinen, einschließlich Proteinbiomarker 1-3 zu prüfen. Obwohl dieser Bereich steht derzeit vor großen Herausforderungen von anderen Hochdurchsatz-Technologien wie Massenspektrometrie (MS), gibt es noch viel Raum für die Nützlichkeit der Antikörper Microarrays, vor allem, weil diese Geräte leisten einfache Dateninterpretation und einfache Schnittstelle mit anderen Tests. In den letzten Jahren hat sich die Integration von Microarrays in die Mikrochip-Gerüsten der Antikörper Microarray eine neue Möglichkeit, gedeihen 4-7 vorgesehen. Zum Beispiel hat der Barcode Microarray in eine Einzelzellmikrochip integriert in Zell-Kommunikation Studien 8,9 verwendet. Diese Technologie hat deutliche Vorteile gegenüber anderen verfügbaren Microarray-Technologien. Es verfügt über Array-Elemente auf 10-100 um, viel kleiner als die typischen 150 um Größe in herkömmlichen Microarray elemen verwendetts. Der Bau von kleineren Arrayelemente mit systematischen Strömungsmusterbildungsverfahren erreicht wird, und dies führt zu kompakten Mikroarrays, die Einzelzell sezernierten Proteinen und intrazellulären Proteinen erkennen kann. Ein weiterer Vorteil ist die Verwendung eines einfachen, instrument freie Konfiguration. Dies ist besonders wichtig, weil die meisten Labors und Kleinunternehmen nicht in der Lage, um Mikroarray-Kerneinrichtungen zugreifen zu können. Solchen Barcode-Antikörper-Mikroarrays mit einer leistungsfähigen Assay Durchsatz und können verwendet werden, um hoch Multiplex-Assays an einzelnen Zellen durchzuführen, während eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität mit der von herkömmlichen Sandwich-Enzym-Immunoassay (ELISA 8) werden. Diese Technologie hat zahlreiche Anwendungen in der Detektion von Proteinen aus Glioblastom 9-11, T-Zellen 12 und 13 zirkulierenden Tumorzellen gefunden. Alternativ Barcode DNA Microarrays allein in der präzisen Positionierung von Neuronen und Astrozyten für mimick genutzt wordening der in vivo Anordnung von Hirngewebe 14.
Dieses Protokoll konzentriert sich nur auf die experimentellen Schritte und Aufbaublöcke der zweidimensionalen (2D) Strichcode-Antikörper-Microarray, die Anwendungsmöglichkeiten in der Detektion von Biomarkern in Fluidproben hat und in einzelne Zellen. Die Technik basiert auf einem adressierbaren einzelsträngig, eindimensionale (1-D) DNA Microarray konstruiert unter Verwendung eines Orthogonal-Oligonukleotide, die sich räumlich auf Glassubstraten gemustert. Der 1-D-Muster gebildet wird, wenn parallele Strömungskanäle in Strömungsmusterungsschritt verwendet, und ein derartiges Muster wird als diskrete Banden visuell ähnlich zu 1-D Universal Product Code (UPC) Barcodes. Der Bau eines 2-D (n x m) Antikörper Array – erinnert an ein 2-D Quick Response (QR) Matrixcode – braucht mehr komplexe Strukturierungsstrategien, sondern ermöglicht für die Immobilisierung von Antikörpern mit einer höheren Dichte 8,15. Die Fertigungerfordert zwei DNA Strukturierungsschritte, wobei das erste Muster senkrecht zu der zweiten. Die Schnittpunkte dieser beiden Muster bilden die n x m Elemente des Arrays. Durch strategische Auswahl der Sequenzen der einzelsträngigen DNA (ssDNA) in Strömungsstrukturierung verwendet wird, wird jedes Element in einem gegebenen Array eine bestimmte Adresse zugewiesen. Diese Raumbezug ist bei der Unterscheidung zwischen Fluoreszenzsignale auf dem Microarray Objektträger notwendig. Die ssDNA-Array in einen Antikörper-Array durch den Einbau von komplementären DNA-Antikörper-Konjugate umgewandelt und bildet eine Plattform genannte DNA-kodierten Antikörperbibliothek (DEAL 16).
Diese Video-Protokoll werden die wichtigsten Schritte bei der Erstellung nxm Antikörperarrays, umfassend die Herstellung schließen Polydimethylsiloxan (PDMS) Barcode Formen, Fließmuster ssDNA in zwei Orientierungen, die Vorbereitung Antikörper-Oligonukleotid-Konjugaten DEAL, und Umwandeln des 3 x 3-DNA-Array in ein 3x 3-Antikörper-Array.
Protocol
Representative Results
Discussion
Strömungsmuster Design ist der erste wichtige Schritt bei der Herstellung der 2-D-Mikroarray. Um zwei überlappende DNA-Muster auf einem Glassubstrat zu erzeugen, müssen die Kanal Merkmale des ersten Design senkrecht zu denen des zweiten (1A-B). Die Entwürfe beachten Sie auch die nachgelagerten Anwendungen des Mikroarrays. Im Fall der Einzelzellanalyse wird der Mikroarray verwendet werden, um Proteine, die von einzelnen Zellen in Mikrokammern umschlossen erfassen, damit die Kanalabmessungen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.
Materials
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see table below | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (0.50 mm diameter) | Electron Microscopy Sciences | 57393 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
References
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