Flow-modèle Fabrication guidée de haute densité Barcode puces à anticorps
Summary
Ce protocole décrit la fabrication d'une grande échelle, deux dimensions ADN ou anticorps réseau multiplexé, avec des applications potentielles dans les études de signalisation cellulaire et la détection de biomarqueurs.
Abstract
Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.
Introduction
Biopuces d'anticorps ont été largement utilisés dans les études protéomiques pour les décennies à examiner la présence de protéines ciblées, y compris des biomarqueurs protéiques 1-3. Bien que ce domaine est actuellement confronté à de grands défis d'autres technologies à haut débit telles que la spectrométrie de masse (MS), il ya encore beaucoup de place pour l'utilitaire de puces à anticorps, principalement parce que ces appareils offrent l'interprétation des données interface simple et facile avec les autres tests. Au cours des dernières années, l'intégration de puces dans des échafaudages de puces a fourni la puce anticorps une nouvelle opportunité de prospérer 4-7. Par exemple, la puce de code à barres intégré dans une puce à cellule unique a été utilisé dans des études de communication cellulaire 8,9. Cette technologie présente des avantages distinctifs par rapport aux autres technologies de microréseaux disponibles. Il dispose d'éléments de tableau à 10-100 um, beaucoup plus petit que le type 150 um taille utilisée dans elemen de biopuces classiquests. La construction d'éléments de réseau est obtenue en utilisant de plus petites approches systématiques structuration d'écoulement, ce qui donne lieu à des puces à ADN compacts capables de détecter des protéines à cellule unique sécrétées et des protéines intracellulaires. Un autre avantage est l'utilisation d'une configuration simple, sans instrument. Ceci est particulièrement important, car la plupart des laboratoires et les petites entreprises peuvent ne pas être en mesure d'accéder microarray installations de base. Un tel code barre, des puces à anticorps disposent améliorées dosage et le débit peuvent être utilisés pour effectuer des tests hautement multiplexés sur des cellules individuelles tout en obtenant une haute sensibilité et une spécificité comparable à celle de dosage immuno-enzymatique en sandwich classique (ELISA 8). Cette technologie a trouvé de nombreuses applications dans la détection de protéines à partir de glioblastome 11.9, les cellules T 12, et des cellules tumorales circulantes 13. Alternativement, les puces à ADN de code à barres seuls ont été utilisés dans le positionnement précis de neurones et les astrocytes pour Mimicknant l'assemblage in vivo des tissus du cerveau 14.
Ce protocole se concentre uniquement sur les étapes expérimentales et blocs accumulation de deux dimensions (2-D) code à barres anticorps microarray qui a des applications potentielles dans la détection de biomarqueurs dans des échantillons fluidiques et dans des cellules individuelles. La technologie est basée sur une adressable simple brin, à une dimension (1-D) puces à ADN construit en utilisant des oligonucleotides qui sont orthogonales à motifs dans l'espace sur des substrats de verre. Le modèle 1-D est formé lorsque les canaux d'écoulement parallèles sont utilisés dans l'étape de flux de motifs, et un tel motif apparaît comme bandes discrètes visuellement similaires à 1-D Universal Product Code (UPC) des codes à barres. La construction d'un 2-D (n x m) réseau d'anticorps – rappelle un 2-D Quick Response (QR) code matriciel – a besoin de stratégies de mise en forme plus complexes, mais permet l'immobilisation d'anticorps à une densité plus élevée de 8,15. La fabricationADN nécessite deux étapes de mise en forme, avec le premier motif perpendiculaires à la seconde. Les points d'intersection de ces deux modèles représentent les m éléments de la matrice n x. En sélectionnant stratégiquement les séquences d'ADN simple brin (ADNsb) utilisé dans l'écoulement de motifs, chaque élément dans un tableau donné se voit attribuer une adresse spécifique. Cette référence spatiale est nécessaire de distinguer entre les signaux de fluorescence sur la lame de microréseau. La matrice ADN à un brin est converti en une série d'anticorps par incorporation de conjugués d'ADN-anticorps complémentaires, formant une plate-forme appelée bibliothèque d'anticorps codé par l'ADN (DEAL 16).
Ce protocole vidéo décrit les étapes clés dans la création de tableaux nxm d'anticorps qui comprennent la préparation (PDMS) de moules de codes à barres, flux-structuration ADNsb dans deux orientations, préparation d'un anticorps-oligonucléotides conjugués DEAL, et en convertissant le tableau 3 x 3 d'ADN dans un 3x 3 anticorps tableau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Conception de modèle de Flow est la première étape critique dans la fabrication de la puce 2-D. Pour générer deux motifs d'ADN qui se chevauchent sur un substrat en verre, les caractéristiques de canal de la première conception doivent être perpendiculaires à celles de la seconde (figure 1A-B). Les dessins considèrent également les applications en aval de la puce. Dans le cas de l'analyse d'une seule cellule, la puce à ADN est utilisée pour détecter des protéine…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.
Materials
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see table below | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (0.50 mm diameter) | Electron Microscopy Sciences | 57393 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
References
- Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., & Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7) (2009).
- Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
- Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., & Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
- Fan, R. et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
- Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., & Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
- Varadarajan, N. et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
- Ma, S. et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
- Wang, J. et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
- Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., & Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
- Xue, M. et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
- Shi, Q. H. et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
- Ma, C. et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
- Deng, Y. et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499 (2014).
- Vermesh, U. et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
- Yu, J. et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
- Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., & Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
- Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
- Ahmad, H. et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301 (2011).
