Undersøgelse af proteiner bundet til Nascent DNA i pattedyrceller Brug BrdU-chip-slot-vestlige Teknik

Summary

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

Abstract

Histondeacetylaser 1 og 2 (HDAC1,2) lokalisere de steder, hvor DNA-replikation. I den tidligere undersøgelse, under anvendelse af en selektiv inhibitor og en genetisk knockdown-system viste vi hidtil ukendte funktioner til HDAC1,2 i replikationsgaffel progression og spirende kromatin vedligeholdelse i pattedyrceller. Desuden har vi brugt en BrdU-chip-slot-vestlig teknik, der kombinerer kromatin immunoprecipitation (chip) af brom-deoxyuridin (BrdU) -mærket DNA med slot blot og vestlige analyser til kvantitativ måling af proteiner eller histon modifikation forbundet med spirende DNA.

Aktivt delende celler blev behandlet med HDAC1,2 selektiv inhibitor eller transficeret med siRNA'er mod HDAC1 og HDAC2 og nyligt syntetiserede DNA blev mærket med thymidinanalogen bromdeoxyuridin (BrdU). BrdU mærkning blev udført på et tidspunkt tidspunkt, hvor der ikke var nogen signifikant cellecyklusstop eller apoptose som følge af tab af HDAC1,2 funktioner. Efter labeling af celler med BrdU, kromatin immunofældning (chip) i histonacetylering mærker eller kromatin-remodeler blev udført med specifikke antistoffer. BrdU-mærkede input DNA og immunpræcipiteret (eller chiped) DNA blev derefter spottet på en membran ved hjælp af slot blot-teknik og immobiliseres ved hjælp af UV. Mængden af ​​spirende DNA i hver slot blev derefter vurderes kvantitativt ved hjælp af Western-analyse med et anti-BrdU-antistof. Virkningen af ​​tab af HDAC1,2 funktioner på niveauerne af nyligt syntetiserede DNA-associeret histonacetylering mærker og chromatin remodeler blev derefter bestemt ved at normalisere BrdU-chip signalet opnået fra de behandlede prøver til kontrolprøverne.

Introduction

Defekt DNA-reparation og / eller DNA-replikation er en væsentlig årsag til genom ustabilitet, hvilket kan udløse celledød. En enkelt udbedrede dobbeltstrengsbrud er tilstrækkelig til at forårsage celledød ^1. Chromatin organisation er forbigående ændres under både replikation og reparation ^2,3, og manglende evne til at opretholde epigenetisk oplysninger under disse processer vil resultere i en trussel mod genome integritet. Tab af HDAC3 eller HDAC1,2 funktion hindrer S-fase progression, DNA-replikation og reparation fører til genotoksisk stress (DNA-skade) og celledød ^4-9. Det er derfor en praktisk strategi at anvende selektive HDAC-inhibitorer at forstyrre replikation, reparation og chromatin i cancerceller og forårsage DNA-skader, der på sin side kan stoppe vækst og inducere celledød selektivt i hurtigt voksende cancerceller.

Under DNA-replikation, er kromatin hurtigt adskilles og derefter samles efter DNA overlapning. Nyligt synthesized histon H4 er acetyleret på K5 og K12 rester (H4K5K12ac) og efter aflejring på kromatin, er de hurtigt deacetyleres af histondeacetylaser (HDAC) ^10,11. Svigt i celler at opretholde spirende kromatin integritet ved histondeacetylering kan føre til sammenbrud gaffel, hvilket igen kan resultere i DNA-skader og celledød. Vi har for nylig vist, at selektiv hæmning af HDAC1,2 øger histonacetylering (H4K5ac, H4K12ac og H4K16ac) og hæmmer SMARCA5 kromatin remodeler aktivitet på spirende kromatin, som korrelerer med reduceret replikation gaffel progression, øget gaffel sammenbrud og øget replikation stress-induceret DNA-skader ⁶ . Således kan HDAC inhibitor behandling ændrer spirende chromatinstruktur at udløse DNA-beskadigelse og død meget hurtigt i cancerceller, da disse celler cyklus hurtigt og passerer mange gange gennem S-fasen. Det er derfor vigtigt at forstå, hvordan HDAC'er funktion at regulere histonacetylering og protein binding at opretholde DNA-replikation i pattedyrceller.

Til kvantitativ måling af mængden af ​​histonacetylering og SMARCA5 kromatin remodeler forbundet med spirende DNA under DNA-replikation, vi udtænkt en modificeret chip assay kaldet BrdU-chip-Slot-Western-teknikken. Efter chromatin immunoprecipitation (chip) af et ønsket protein eller histon modifikation, mængden af ​​spirende DNA (mærket ved anvendelse thymidinanalog, BrdU) i chippen prøven kan detekteres under anvendelse western analyse af BrdU-mærkede chip DNA overført til en membran ved hjælp af et slot blot apparat. Med denne teknik, viste vi, at H4K16ac (et varemærke involveret i chromatin emballage) og ISWI familiemedlem SMARCA5 (SWI / SNF-relateret matrix-associeret actin-afhængig regulator af kromatin) chromatin remodeler er forbundet med spirende DNA i S-fase celler ^6. Vi fandt også, at den spirende H4K16ac mærket deacetyleres af HDAC1,2 under DNA-replikation ^6. H4K16ac hæmmerkromatin remodeler aktivitet ISWI familiemedlem SMARCA5 ^12. Derfor, ved hjælp af BrdU-CHIP-Slot-vestlig teknik, kunne vi slutte funktionerne for HDAC1,2 i reguleringen kromatin remodellering under DNA-replikation. Derfor er BrdU-chip-slot-Western Blot teknikken er en kraftfuld metode til kvantitativ måling de associerings- og dissociation dynamik proteiner eller deres post-translationelle modifikationer, der er bundet til spirende DNA.

Protocol

1. chromatin immunpræcipitering (chip) efter BrdU Labeling Kultur NIH3T3-celler i nærværelse af enten DMSO eller HDAC1,2-selektive inhibitorer som beskrevet tidligere 6. Efter behandling med DMSO eller HDAC1,2 selektive inhibitorer, tilsættes BrdU til cellerne i en steril vævskultur hætte. Inkuber 2 x 10 6 NIH3T3 celler udpladet i 10 ml NIH3T3 medier med en 20 uM slutkoncentration på bromdeoxyuridin (BrdU) i 60 minutter i et sterilt 37 ° C vævsdyrkningsinkubator. …

Representative Results

For at bestemme specificiteten af HDAC1,2-selektive inhibitorer blev Hdac1,2 FL / FL og HDAC3 FL / FL fibrosarcomceller brugt. Adenovirusholdige Cre-rekombinase (Cre-Ad) blev anvendt til at slette Hdac1,2 og HDAC3 i disse celler. Efter Ad-Cre infektion af Hdac1,2 FL / FL celler, blev en solid stigning i H4K5ac observeret. Behandling af Hdac1,2 knockout celler med 233 eller 898 res…

Discussion

Beskrevet i dette manuskript protokol er et relativt hurtig metode til at påvise tilstedeværelsen af ​​proteiner eller deres posttranslationelt modificerede former på nyligt replikeret eller spirende DNA. Desuden er denne teknik tillader én at måle associering-dissociationskinetikken af ​​et protein eller sin ændrede form med spirende DNA. Denne teknik er et supplement til den elegante iPOND teknologi ^13. I iPOND teknologi, er nyligt syntetiseret DNA mærket med ethyl deoxyuridin (edu). En bioti…

Materials

Anti-BrdU (westerns)	BD Biosciences	B555627
Anti-SMARCA5	Abcam	ab3749
Anti-H4K16ac	Active Motif	39167
Zeta-Probe GT Membrane	Bio-Rad	162-0197
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
Protein A agarose	Millipore	16-156
Rnase A	Qiagen	19101
Proteinase K	Sigma	P4850
PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Glycine	Sigma	G7403
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
BrdU	Sigma	B9285
Rabbit IgG	Millipore	12-370
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma	S-3014
Triton-X-100	Sigma	93443
NP40	USB Corporation	19628
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium bicarbonate	Sigma	S-4019
Ethanol	Decon Laboratories	04-355-222
DEPC-treated water	Sigma	95284
Tris	Fisher	BP-152-5
EDTA	Invitrogen	15575-020
SDS	Ambion	AM9820
Sodium hydroxide	Mallinckrodt GenAR	MAL7772-06
20X SSC	Life Technologies	15557-036
Non-fat dry milk	Lab Scientific Inc	M0841
ECL	Thermo Fisher	80196
X-ray film	Genesee Sci	30-101
Developer	Konica Minolta	SRX-101A
UV Crosslinker	Stratagene	XLE-1000
Sonicator	Branson Sonifier  Digital Ultrasonic Cell Disruptor	Model: 450
Centrifuge	Eppendorf	Model: 5810R
Water bath	Fisher Scientific Isotemp	Model: 2322
NanoDrop 1000 spectrophotometer	ThermoScientific	Model: 1000
Slot Blot apparatus	Schleicher and Schuell Minifold II	44-27570
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators