Memeli Hücrelerde Nascent DNA Bound Proteinlerin incelenmesi BrdU ChIP-Slot-Batı Tekniği

Özet

Bu protokolde, yeni sentezlenen veya yeni ortaya çıkan DNA ile ilişkili proteinleri ve histon modifikasyonlarını incelemek için yeni bir BrdU-ChIP-Slot-Western tekniğini açıklıyoruz.

Özet

Histon deasetilaz 1 ve 2 (HDAC1,2) DNA replikasyonunun bölgelerine yerleşemez. Önceki bir çalışmada, seçici bir inhibitörü ve genetik demonte sistemi kullanılmasıyla, çoğalma çatala ilerlemesi ve memeli hücrelerinde doğmakta olan kromatin bakım HDAC1,2 için yeni fonksiyonlar göstermiştir. Ayrıca, yuva leke ile brom-deoksiüridin (BrdU) -etiketli DNA kromatin immunoprecipitation (ChIP) birleştiren ve Batı nicel doğmakta olan DNA ile ilişkili proteinler veya histon modifikasyonu ölçmek için analizler bir BrdU-ChIP-Slot-Batı tekniği kullanılmıştır.

Aktif bölünen hücreler HDAC1,2 selektif inhibitörü ile tedavi edilebilen veya HDAC1 ve HDAC2 karşı siRNA'lar transfekte edilmiş ve daha sonra, yeni sentezlenmiş DNA, timidin analog bromodeoksiüridin (BrdU) ile etiketlenmiştir edildi. Önemli bir hücre döngüsü tutuklama veya apoptozis varken BrdU etiketleme nedeniyle HDAC1,2 fonksiyonlarının kaybına bağlı olarak bir zaman noktasında yapılmıştır. Aşağıdakı lBrdU histon asetilasyonu bakışı, Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) veya kromatin remodeler hücrelerin Abeling spesifik antikorlar ile gerçekleştirildi. BrdU etiketli giriş DNA çökeltilmiş (veya chiped) DNA daha sonra slot blot tekniği kullanılarak bir membran üzerine noktalar ve UV kullanılarak immobilize edildi. Her yuvaya doğmakta olan DNA miktarı, kantitatif bir anti-BrdU antikoru ile Western analizi kullanılarak değerlendirildi. Yeni sentezlenen DNA ile ilişkili histon asetilasyonu işaretleri ve kromatin Remodeler seviyeleri üzerindeki HDAC1,2 fonksiyonlarının kaybı etkisinin daha sonra kontrol numunelerine ile muamele edilmiş örneklerde elde edilen BrdU-yongası sinyali normalize ederek belirlenir.

Giriş

Kusurlu DNA onarım ve / veya DNA replikasyon hücre ölümünü tetikleyebilir genom istikrarsızlık, önemli bir nedeni vardır. Tek onarılmamış çift iplikli sonu hücre ölümüne neden ¹ için yeterlidir. Kromatin organizasyonu geçici, hem çoğaltma sırasında değişmiş ve ^2,3 onarmak ve bu süreçlerin bütünlüğünü genom için bir tehdit neden olacaktır sırasında epigenetik bilgileri korumak için başarısızlık olduğunu. HDAC3 veya HDAC1,2 fonksiyon kaybı genotoksik strese (DNA hasarının) ve hücre ölümüne yol açan ^4-9 S-faz ilerlemesi, DNA replikasyonu ve onarımı engellemektedir. Bu nedenle, kanser hücrelerinde replikasyon, onarım ve kromatin bozabilir....

Protokol

BrdU Etiketleme aşağıdaki 1. Kromatin immünopresipitasyon (ChIP)

1. DMSO veya HDAC1,2 seçici önleyicileri, ya mevcudiyetinde kültür NIH3T3 hücreleri, daha önce tarif edildiği ^{gibi, 6.}
2. DMSO veya HDAC1,2 seçici inhibitörler ile işlendikten sonra, steril doku kültürü kaputu hücrelere BrdU ekleyin. Steril 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesi içinde 60 dakika için bromodeoksiüridin bir 20 uM nihai konsantrasyon (BrdU) ile 10 mi NIH3T3 ortamda kaplanmıştır 2 x 10 ^6, NIH3T3 hücreleri inkübe edin.
3. % 1 bir son konsantrasyonda kültür ortamına doğrudan formaldehid eklenerek DNA çapraz bağ hücre içi proteinlerdir. Bir çalkalayıcı....

Sonuçlar

HDAC1,2 seçici önleyicileri özgüllüğünü belirlemek için, Hdac1,2 ^{FL / FL} ve HDAC3 ^{FL / FL} fibrosarkom hücreleri kullanıldı. Adenovirüs içeren Cre rekombinaz (Cre Ad-) bu hücrelerde Hdac1,2 ve HDAC3 silmek için kullanılmıştır. Hdac1,2 ^{FL / FL} ardından Ad-Cre enfeksiyonu Hücreler, H4K5ac sağlam bir artış gözlenmiştir. 233 ya da 898 ile Hdac1,2 knockout hücre tedavisi 233 ve 898, bu .......

Tartışma

Bu yazıda tarif edilen protokol, yeni çoğaltılmış ya da doğan DNA protein veya translasyon sonrası modifiye edilmiş formları varlığını göstermek için nispeten hızlı bir yöntemidir. Buna ek olarak, bu teknik, bir protein ya da doğan DNA ile değiştirilmiş bir biçiminin bağlanma-ayrılma kinetikleri ölçmek için bir olanak sağlamaktadır. Bu teknik zarif iPOND teknolojisi ¹³ tamamlayıcıdır. IPOND teknolojisinde, yeni sentezlenmiş DNA, etil deoksiüridin (edu) ile etiketlenir. Bir biyotin konjuge sonra tıklama kimyas.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-BrdU (westernler)	BD Biosciences	B555627
Anti-SMARCA5	Abcam	ab3749
Anti-H4K16ac	Aktif Motif	39167
Zeta-Probe GT Membran	Bio-Rad	162-0197
Formaldehit	Fisher	BP531-500
Protein A agaroz	Millipore	16-156
Rnase A	Qiagen	19101
Proteinaz K	Sigma	P4850
PCR Saflaştırma Kiti	Qiagen	28106
Glisin	Sigma	G7403
Proteaz inhibitörü kokteyli	Roche	11836170001
BrdU	Sigma	B9285
Tavşan IgG & nbsp;	Kırlangıç	12-370
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma	S-3014
Triton-X-100	Sigma	93443
NP40	USB Şirketi	19628
Sodyum deoksikolat	Sigma	D6750
Sodyum bikarbonat	Sigma	S-4019
Etanol	Decon Laboratuvarları	04-355-222
DEPC ile arıtılmış su	Sigma	95284
Tris	Fisher	BP-152-5
EDTA	Invitrogen	15575-020
SDS	Ambion	AM9820
Sodyum hidroksit	Mallinckrodt GenAR ve nbsp;	MAL7772-06
20x SSC	Yaşam Teknolojileri	15557-036
Yağsız kuru süt	Lab Scientific Inc	M0841
ECL	Thermo Fisher	80196
X-ışını filmi	Genesee Sci	30-101
Geliştirici	Konica Minolta	SRX-101A
UV Çapraz Bağlayıcı	Stratagene	XLE-1000
Sonikatör	Branson Sonifier  Dijital Ultrasonik Hücre Bozucu	Model: 450
Santrifüj	Eppendorf	Model: 5810R
Su banyosu	Fisher Scientific Isotemp	Model: 2322
NanoDrop 1000 spektrofotometre	ThermoScientific	Model: 1000
Yuva Leke aparatı	Schleicher ve Schuell Minifold II	44-27570
Doku Kültürü İnkübatörü	Thermo Scientific	Series II 3110 Su Ceketli CO2 İnkübatörleri