Memeli Hücrelerde Nascent DNA Bound Proteinlerin incelenmesi BrdU ChIP-Slot-Batı Tekniği
Summary
In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.
Abstract
Histon deasetilaz 1 ve 2 (HDAC1,2) DNA replikasyonunun bölgelerine yerleşemez. Önceki bir çalışmada, seçici bir inhibitörü ve genetik demonte sistemi kullanılmasıyla, çoğalma çatala ilerlemesi ve memeli hücrelerinde doğmakta olan kromatin bakım HDAC1,2 için yeni fonksiyonlar göstermiştir. Ayrıca, yuva leke ile brom-deoksiüridin (BrdU) -etiketli DNA kromatin immunoprecipitation (ChIP) birleştiren ve Batı nicel doğmakta olan DNA ile ilişkili proteinler veya histon modifikasyonu ölçmek için analizler bir BrdU-ChIP-Slot-Batı tekniği kullanılmıştır.
Aktif bölünen hücreler HDAC1,2 selektif inhibitörü ile tedavi edilebilen veya HDAC1 ve HDAC2 karşı siRNA'lar transfekte edilmiş ve daha sonra, yeni sentezlenmiş DNA, timidin analog bromodeoksiüridin (BrdU) ile etiketlenmiştir edildi. Önemli bir hücre döngüsü tutuklama veya apoptozis varken BrdU etiketleme nedeniyle HDAC1,2 fonksiyonlarının kaybına bağlı olarak bir zaman noktasında yapılmıştır. Aşağıdakı lBrdU histon asetilasyonu bakışı, Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) veya kromatin remodeler hücrelerin Abeling spesifik antikorlar ile gerçekleştirildi. BrdU etiketli giriş DNA çökeltilmiş (veya chiped) DNA daha sonra slot blot tekniği kullanılarak bir membran üzerine noktalar ve UV kullanılarak immobilize edildi. Her yuvaya doğmakta olan DNA miktarı, kantitatif bir anti-BrdU antikoru ile Western analizi kullanılarak değerlendirildi. Yeni sentezlenen DNA ile ilişkili histon asetilasyonu işaretleri ve kromatin Remodeler seviyeleri üzerindeki HDAC1,2 fonksiyonlarının kaybı etkisinin daha sonra kontrol numunelerine ile muamele edilmiş örneklerde elde edilen BrdU-yongası sinyali normalize ederek belirlenir.
Introduction
Kusurlu DNA onarım ve / veya DNA replikasyon hücre ölümünü tetikleyebilir genom istikrarsızlık, önemli bir nedeni vardır. Tek onarılmamış çift iplikli sonu hücre ölümüne neden 1 için yeterlidir. Kromatin organizasyonu geçici, hem çoğaltma sırasında değişmiş ve 2,3 onarmak ve bu süreçlerin bütünlüğünü genom için bir tehdit neden olacaktır sırasında epigenetik bilgileri korumak için başarısızlık olduğunu. HDAC3 veya HDAC1,2 fonksiyon kaybı genotoksik strese (DNA hasarının) ve hücre ölümüne yol açan 4-9 S-faz ilerlemesi, DNA replikasyonu ve onarımı engellemektedir. Bu nedenle, kanser hücrelerinde replikasyon, onarım ve kromatin bozabilir ve bu da büyümeyi durdurur ve hızlı bir şekilde büyüyen bir kanser hücrelerinde seçici hücre ölümünü teşvik DNA hasarına neden seçici HDAC inhibitörlerinin kullanımı pratik bir stratejidir.
DNA replikasyonu sırasında, kromatin hızla sökülüp ve daha sonra DNA çoğaltılması takip yeniden birleştirilen. Yeni synthesized histon H4 kromatinden üzerine K5 ve K12 kalıntılarının (H4K5K12ac) ve aşağıdaki birikimi asetillenebilir edilir hızla histon deasetilazların (HDAC'ler) 10,11 tarafından deasetile edilir. Histon deasetilasyonu ile oluşmakta olan kromatin bütünlüğünü korumak için hücrelerin hatası da, DNA hasarı ve hücre ölümüne neden olabilir çatal çöküşü, yol açabilir. Biz son zamanlarda HDAC1,2 selektif inhibisyonu artırır histon asetilasyonu (H4K5ac, H4K12ac ve H4K16ac) ve azaltılmış çoğaltma çatal ilerlemesi ile ilişkilidir doğmakta kromatin üzerinde SMARCA5 kromatin remodeler aktivitesini inhibe olduğunu gösterdi çatal çöküşü artmış ve çoğaltma strese bağlı DNA hasarı 6 arttı . Bu nedenle, HDAC inhibitörü tedavisi hızla bu hücrelerin döngüsü olarak, kanser hücrelerinde çok hızlı bir şekilde, DNA hasarı ve ölümü tetikleyebilir ve S-fazı yoluyla birçok kez geçmek için oluşmakta olan kromatin yapısını değiştirebilir. Bu HDAC'ler histon asetilasyonunu ve protein Bindi düzenleyen nasıl işlediğini anlamak önemlidirng memeli hücrelerinde DNA replikasyonu korumak için.
Kantitatif histon asetilasyonu ve DNA replikasyonu sırasında doğmakta olan DNA ile ilişkili SMARCA5 kromatin Remodeler miktarını ölçmek için, bir modifiye ChIP tahlil BrdU-ChIP-Slot-Batı tekniği denilen geliştirmiştir. Bir yarık kullanılarak zar üzerine arzu edilen bir protein ya da histon modifikasyonu kromatin, immüno-çökeltme (chip) takiben, henüz olgunlaşmamış DNA miktarı BrdU etiketli yonga DNA batı analizi kullanılarak tespit edilebilir çips numunesi olarak (timidin analoğu BrdU ile işaretlenmiş) transfer Leke aygıt. Bu tekniği kullanarak, H4K16ac (kromatin paket yer alan bir marka) ve ISWI aile üyesi SMARCA5 (kromatin SWI / SNF ilişkili matris ile ilişkili aktin bağımlı regülatör) kromatin remodeler S-fazı hücrelerinde doğmakta olan DNA ile ilişkili olduğunu göstermiştir 6. Biz de doğmakta olan H4K16ac işareti DNA replikasyonu sırasında 6 HDAC1,2 tarafından deasetile olduğunu gördük. H4K16ac inhibeISWI aile üyesi SMARCA5 12 kromatin remodeler aktivitesi. Bu nedenle, BrdU-CHIP-Slot-Batı tekniği kullanılarak, DNA replikasyonu sırasında kromatin remodeling düzenlenmesinde HDAC1,2 işlevlerini bağlayabilirsiniz. Bu nedenle, BrdU-çip-Slot Blot tekniği kantitatif oluşmakta olan DNA'ya bağlanan proteinlerin ya da bunların post-translasyonel modifikasyonlar, birleşme ve ayrılma dinamiklerini ölçmek için güçlü bir yaklaşım.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda tarif edilen protokol, yeni çoğaltılmış ya da doğan DNA protein veya translasyon sonrası modifiye edilmiş formları varlığını göstermek için nispeten hızlı bir yöntemidir. Buna ek olarak, bu teknik, bir protein ya da doğan DNA ile değiştirilmiş bir biçiminin bağlanma-ayrılma kinetikleri ölçmek için bir olanak sağlamaktadır. Bu teknik zarif iPOND teknolojisi 13 tamamlayıcıdır. IPOND teknolojisinde, yeni sentezlenmiş DNA, etil deoksiüridin (edu) ile etiketlenir. Bir …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yazıda iş Radyasyon Onkolojisi Bölümü ve Huntsman Kanser Enstitüsü ve SB Sağlık hibe Ulusal Enstitüsü (R01-CA188520) fon tarafından desteklenmiştir. Ben protokol gösteren ve avantajlarını açıklayan benim laboratuvar Danielle Johnson ve Steven Bennett teşekkür ederiz. Ben yazının eleştirel yorumlar için Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Kanser Enstitüsü) müteşekkirim.
Materials
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20X SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
References
- Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. , (2010).
- Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. 128, 721-733 (2007).
- Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains. Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).
- Bhaskara, S., et al. Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control. Mol Cell. 30, 61-72 (2008).
- Bhaskara, S., Hiebert, S. W. Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability. Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).
- Bhaskara, S., et al. Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression. Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).
- Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
- Johnson, D. P., et al. HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma. Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).
- Bhaskara, S. Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers. Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).
- Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. Duplication and maintenance of heterochromatin domains. J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).
- Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492, 280-284 (2012).
- Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).
