In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.
Histonas desacetilasas 1 y 2 (HDAC1,2) localizar a los sitios de la replicación del ADN. En el estudio anterior, el uso de un inhibidor selectivo y un sistema de caída genética, mostramos funciones novedosas para HDAC1,2 en la replicación del tenedor progresión y mantenimiento de la cromatina naciente en células de mamífero. Además, se utilizó una técnica de BrdU-chip-Slot-occidental que combina la cromatina immunoprecipitation (CHIP) de bromo-desoxiuridina (BrdU) ADN marcado con con slot blot y análisis Western para medir cuantitativamente las proteínas o modificación de las histonas asociadas con el ADN naciente.
Activamente células que se dividen fueron tratados con HDAC1,2 inhibidor selectivo o transfectadas con siRNAs contra HDAC1 y HDAC2 y luego ADN recién sintetizado se marcó con el análogo de la timidina bromodesoxiuridina (BrdU). El etiquetado BrdU se realizó en un punto de tiempo cuando no había detención del ciclo celular o apoptosis significativa debido a la pérdida de las funciones HDAC1,2. Después de lAbeling de las células con BrdU, inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) de las marcas de acetilación de histonas o la cromatina-remodelador se realizó con anticuerpos específicos. El ADN de entrada BrdU-etiquetado y la immunoprecipitated (o chiped) ADN fue descubierto en una membrana utilizando la técnica de transferencia de ranura y inmovilizaron utilizando UV. La cantidad de ADN naciente en cada ranura a continuación, se evaluó cuantitativamente utilizando el análisis de Western con un anticuerpo anti-BrdU. A continuación, el efecto de la pérdida de las funciones HDAC1,2 sobre los niveles de ADN asociado a histonas marcas de acetilación recién sintetizadas y remodelador de la cromatina se determinó mediante la normalización de la señal BrdU-Chip obtenido a partir de las muestras tratadas a las muestras de control.
La reparación del ADN defectuoso y / o la replicación del ADN son una causa principal de la inestabilidad del genoma, lo que puede desencadenar la muerte celular. Una sola sin reparar rotura de doble cadena es suficiente para causar la muerte celular 1. Organización de la cromatina se altera transitoriamente tanto durante la replicación y la reparación de 2,3, y el fracaso para mantener la información epigenética durante estos procesos se traducirá en una amenaza para la integridad del genoma. Pérdida de HDAC3 o función HDAC1,2 impide la progresión de la fase S, la replicación y reparación del ADN que conduce a estrés genotóxico (daño en el ADN) y la muerte celular 4-9. Es por lo tanto una estrategia práctica para usar inhibidores de HDAC selectivos para interrumpir la replicación, reparación y la cromatina en las células cancerosas y causar daño en el ADN, que a su vez puede detener el crecimiento y la muerte celular selectivamente inducir en las células cancerosas que crecen rápidamente.
Durante la replicación del ADN, la cromatina se desmonta rápidamente y luego se vuelve a montar después de la duplicación del ADN. Recién syhistona H4 nthesized es acetilada en K5 y K12 residuos (H4K5K12ac) y después de la deposición sobre la cromatina, se deacetylated rápidamente por desacetilasas de histonas (HDAC) 10,11. El fracaso de las células para mantener la integridad de la cromatina naciente por desacetilación de histonas puede conducir al colapso tenedor, que a su vez puede dar lugar a daños en el ADN y la muerte celular. Recientemente hemos demostrado que la inhibición selectiva de HDAC1,2 aumenta la acetilación de histonas (H4K5ac, H4K12ac y H4K16ac) e inhibe la actividad smarca5 remodelador de cromatina en la cromatina naciente, que se correlaciona con una menor progresión de tenedor de replicación, aumentamos colapso tenedor y el aumento de la replicación del daño en el ADN inducido por el estrés 6 . Así, el tratamiento inhibidor de HDAC puede alterar la estructura de cromatina naciente para desencadenar el daño del ADN y la muerte muy rápidamente en las células cancerosas, ya que estos ciclo de las células rápidamente y pasar muchas veces a través de la fase S. Por tanto, es importante entender cómo las HDAC funcionan para regular la acetilación de histonas y proteínas binding para mantener la replicación del ADN en células de mamífero.
Para medir cuantitativamente la cantidad de acetilación de histonas y smarca5 remodelador de cromatina asociada con el ADN naciente durante la replicación del ADN, ideamos un chip de ensayo modificado llama la técnica de BrdU-chip-Slot-occidental. Después de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de una modificación de la proteína o histona se desea, la cantidad de ADN naciente (marcó usando análogo de la timidina, BrdU) en la muestra de chip puede ser detectado mediante análisis de Western de DNA chip BrdU marcado con transfirió a una membrana usando un Slot aparato Blot. Mediante esta técnica, se demostró que H4K16ac (una marca implicada en el embalaje de la cromatina) y el miembro de la familia ISWI smarca5 (actina dependiente regulador de la matriz asociada relacionada con el SNF SWI / de la cromatina) remodelador de cromatina se asocian con el ADN naciente en las células en fase S 6. También se encontró que la marca naciente H4K16ac se desacetila por HDAC1,2 durante la replicación del ADN 6. Inhibe H4K16acactividad remodelador de cromatina del familiar ISWI smarca5 12. Por lo tanto, utilizando la técnica de BrdU-CHIP-Slot-Western, podríamos conectar las funciones para HDAC1,2 en la regulación de remodelación de la cromatina durante la replicación del ADN. Por lo tanto, la técnica BrdU-chip-Slot-Western Blot es un enfoque poderoso para medir cuantitativamente la dinámica de asociación y disociación de proteínas o sus modificaciones posteriores a la traducción que se unen al ADN naciente.
El protocolo se describe en este manuscrito es un método relativamente rápido para demostrar la presencia de las proteínas o sus formas modificadas post-traduccionalmente en el ADN recién replicado o naciente. Además, esta técnica permite que un para medir la cinética de asociación-disociación de una proteína o su forma modificada con el ADN naciente. Esta técnica es complementaria a la tecnología elegante ipond 13. En la tecnología ipond, ADN recién sintetizado se etiqueta con acetato de desoxi…
The authors have nothing to disclose.
El trabajo en este manuscrito fue apoyada por fondos del Departamento de Oncología Radioterápica y el Instituto de Cáncer Huntsman y el Instituto Nacional de la concesión de la Salud (R01-CA188520) de SB. Doy las gracias a Danielle Johnson y Steven Bennett en mi laboratorio para demostrar el protocolo y explicar sus beneficios. Agradezco al Dr. Mahesh Chandrasekharan (Instituto de Cáncer Huntsman) para comentarios críticos sobre el manuscrito.
Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
Rnase A | Qiagen | 19101 | |
Proteinase K | Sigma | P4850 | |
PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Glycine | Sigma | G7403 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
BrdU | Sigma | B9285 | |
Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
NaCl | Sigma | S-3014 | |
Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
NP40 | USB Corporation | 19628 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
Tris | Fisher | BP-152-5 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
SDS | Ambion | AM9820 | |
Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
20X SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |