Undersøkelse av Proteiner Bundet til begynnende DNA i pattedyrceller Bruke BrdU-chip-Slot-vestlig Technique

Summary

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

Abstract

Histone deacetylases 1 og 2 (HDAC1,2) lokaliseres til områder av DNA replikasjon. I forrige undersøkelse, ved hjelp av en selektiv inhibitor og en genetisk knockdown system, vi viste nye funksjoner for HDAC1,2 i replikasjonsgaffelen progresjon og gryende kromatin vedlikehold i pattedyrceller. I tillegg brukte vi en BrdU-Chip-Slot-vestlig teknikk som kombinerer kromatin immunopresipitering (chip) av brom-deoksyuridin (BrdU) -merket DNA med slot blot og Vest-analyser for å kvantitativt måle proteiner eller histone modifisering assosiert med begynnende DNA.

Aktivt delende celler ble behandlet med HDAC1,2 selektiv hemmer eller transfektert med sirnas mot Hdac1 og Hdac2 og deretter nysyntetiserte DNA ble merket med tymidinanalog bromdeoksyuridin (BrdU). Den BrdU Merkingen ble utført på et tidspunkt da det ikke var noen signifikant cellesyklus-stans eller apoptose på grunn av tap av HDAC1,2 funksjoner. Etter labeling av celler med BrdU, kromatin immunopresipitering (chip) av histon acetylering merkene eller kromatin-remo ble utført med spesifikke antistoffer. BrdU-merkede DNA-inngang og immunpresipitert (eller chiped) DNA ble deretter flekket på en membran ved hjelp av slissen blot teknikken og immobilisert ved hjelp av UV. Mengden av begynnende DNA i hvert spor ble deretter kvantitativt vurdert ved hjelp av Western-analyse med et anti-BrdU-antistoff. Effekten av tap av HDAC1,2 funksjoner på nivåene av nylig syntetiserte DNA-assosiert histon acetylering tegnene og kromatin remo ble deretter bestemt ved å normalisere BrdU-ChIP signal oppnådd fra de behandlede prøvene til kontrollprøvene.

Introduction

Defekt DNA reparasjon og / eller DNA-replikasjon er en vesentlig årsak til genom ustabilitet, noe som kan føre til celledød. En enkelt ureparert dobbel tråd pause er tilstrekkelig til å forårsake celledød ^en. Chromatin organisasjonen er forbigående endret under både replikasjon og reparasjon ^2,3, og unnlatelse av å opprettholde epigenetisk informasjon i løpet av disse prosessene vil resultere i en trussel mot genom integritet. Tap av HDAC3 eller HDAC1,2 funksjon hindrer S-fase progresjon, DNA replikasjon og reparasjon fører til genotoksisk belastning (DNA skade) og celledød ^4-9. Det er derfor en praktisk strategi for å bruke selektive HDAC-inhibitorer for å forstyrre replikasjon, reparasjon og kromatin i kreftceller og føre til DNA-skade, som i sin tur kan stoppe vekst og induserer celledød selektivt i raskt voksende kreftceller.

Under DNA replikasjon, er kromatin raskt demonteres og deretter satt sammen igjen etter DNA duplisering. Nylig synthesized histon H4 acetyleres på K5 og K12 rester (H4K5K12ac) og følgende avsetning på kromatin, blir de raskt deacetyleres av histon deacetylases (HDACs) ^10,11. Svikt i cellene for å opprettholde integriteten av nascerende kromatin histon-deacetylering kan føre til kollaps gaffel, som i sin tur kan føre til DNA-skade og celledød. Vi har nylig viste at selektiv hemming av HDAC1,2 øker histon acetylering (H4K5ac, H4K12ac og H4K16ac) og hemmer SMARCA5 kromatin remo aktivitet på begynnende kromatin, som korrelerer med redusert replikasjonsgaffelen progresjon, økt gaffel kollaps og økt replikering stressindusert DNA-skader ⁶ . Således kan HDAC-inhibitor behandling forandre begynnende kromatinstruktur å utløse DNA-skade og død meget raskt i kreftceller, da disse celler syklusen raskt og passerer flere ganger gjennom S-fasen. Det er derfor viktig å forstå hvordan HDACs fungere å regulere histon acetylering og protein binding for å opprettholde DNA-replikasjon i pattedyrceller.

Å kvantitativt måle mengden av histon acetylering og SMARCA5 kromatin remo assosiert med begynnende DNA ved DNA-replikasjon, har vi utviklet en modifisert ChIP assay kalt BrdU-chip-Slot-vestlig teknikk. Etter kromatin immunoutfelling (chip) for et ønsket protein eller histone modifikasjon, mengden av begynnende DNA (merket ved anvendelse av tymidinanalog, BrdU) i brikken prøve kan påvises ved hjelp av Western-analyse av BrdU-merkede ChIP DNA overført til en membran ved hjelp av en spilleautomat Blot apparat. Ved hjelp av denne teknikken, viste vi at H4K16ac (et merke som er involvert i kromatin emballasje) og ISWI familiemedlem SMARCA5 (SWI / SNF-relaterte matrix-forbundet aktin avhengig regulator av kromatin) kromatin remo er assosiert med begynnende DNA i S-fase celler ^6. Vi fant også at den gryende H4K16ac mark deacetyleres av HDAC1,2 under DNA replikasjon ^6. H4K16ac hemmerkromatin remo aktivitet av ISWI familiemedlem SMARCA5 ^12. Derfor bruker BrdU-CHIP-Slot-vestlig teknikk, kunne vi koble funksjonene for HDAC1,2 i regulering kromatin remodelle under DNA replikasjon. Derfor er BrdU-Chip-Slot-Western Blot teknikken en kraftig tilnærming til kvantitativt måle foreningen og dissosiasjon dynamikken i proteiner eller deres post-translasjonelle modifikasjoner som er bundet til begynnende DNA.

Protocol

1. Chromatin immunoutfelling (chip) følgende BrdU merking Kultur NIH3T3-celler i nærvær av enten DMSO eller HDAC1,2-selektive inhibitorer som tidligere beskrevet seks. Etter behandling med DMSO eller HDAC1,2 selektive inhibitorer, tilsett BrdU til cellene i et sterilt vevskultur hette. Inkuber 2 x 10 6 NIH3T3-celler sådd ut i 10 ml NIH3T3 medier med en 20 pM sluttkonsentrasjon på bromdeoksyuridin (BrdU) i 60 minutter i en steril 37 ° C vevskulturinkubator. Tverr…

Representative Results

For å bestemme spesifisiteten av HDAC1,2-hemmere, ble Hdac1,2 FL / FL og Hdac3 FL / FL fibrosarkom celler brukes. Adenovirus-inneholdende Cre rekombinase (Ad-Cre) ble brukt til å slette Hdac1,2 og Hdac3 i disse cellene. Etter Ad-Cre infeksjon av Hdac1,2 FL / FL -celler, ble en sterk økning i H4K5ac observert. Behandling av Hdac1,2 knockout celler med 233 eller 898 resulterte ik…

Discussion

Den protokoll som er beskrevet i dette manuskriptet er en relativt rask metode for å demonstrere nærværet av proteiner eller deres post-translasjonelt modifiserte former for nylig replikerte eller begynnende DNA. I tillegg tillater denne teknikken en å måle krets-dissosiasjons-kinetikk av et protein eller dets modifisert form med begynnende DNA. Denne teknikken er komplementær til den elegante iPOND teknologi ^13. I iPOND teknologi, er nylig syntetisert DNA merket med etyl deoksyuridin (Edu). En biotinko…

Materials

Anti-BrdU (westerns)	BD Biosciences	B555627
Anti-SMARCA5	Abcam	ab3749
Anti-H4K16ac	Active Motif	39167
Zeta-Probe GT Membrane	Bio-Rad	162-0197
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
Protein A agarose	Millipore	16-156
Rnase A	Qiagen	19101
Proteinase K	Sigma	P4850
PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Glycine	Sigma	G7403
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
BrdU	Sigma	B9285
Rabbit IgG	Millipore	12-370
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma	S-3014
Triton-X-100	Sigma	93443
NP40	USB Corporation	19628
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium bicarbonate	Sigma	S-4019
Ethanol	Decon Laboratories	04-355-222
DEPC-treated water	Sigma	95284
Tris	Fisher	BP-152-5
EDTA	Invitrogen	15575-020
SDS	Ambion	AM9820
Sodium hydroxide	Mallinckrodt GenAR	MAL7772-06
20X SSC	Life Technologies	15557-036
Non-fat dry milk	Lab Scientific Inc	M0841
ECL	Thermo Fisher	80196
X-ray film	Genesee Sci	30-101
Developer	Konica Minolta	SRX-101A
UV Crosslinker	Stratagene	XLE-1000
Sonicator	Branson Sonifier  Digital Ultrasonic Cell Disruptor	Model: 450
Centrifuge	Eppendorf	Model: 5810R
Water bath	Fisher Scientific Isotemp	Model: 2322
NanoDrop 1000 spectrophotometer	ThermoScientific	Model: 1000
Slot Blot apparatus	Schleicher and Schuell Minifold II	44-27570
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators