In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.
Histone deacetylases 1 og 2 (HDAC1,2) lokaliseres til områder av DNA replikasjon. I forrige undersøkelse, ved hjelp av en selektiv inhibitor og en genetisk knockdown system, vi viste nye funksjoner for HDAC1,2 i replikasjonsgaffelen progresjon og gryende kromatin vedlikehold i pattedyrceller. I tillegg brukte vi en BrdU-Chip-Slot-vestlig teknikk som kombinerer kromatin immunopresipitering (chip) av brom-deoksyuridin (BrdU) -merket DNA med slot blot og Vest-analyser for å kvantitativt måle proteiner eller histone modifisering assosiert med begynnende DNA.
Aktivt delende celler ble behandlet med HDAC1,2 selektiv hemmer eller transfektert med sirnas mot Hdac1 og Hdac2 og deretter nysyntetiserte DNA ble merket med tymidinanalog bromdeoksyuridin (BrdU). Den BrdU Merkingen ble utført på et tidspunkt da det ikke var noen signifikant cellesyklus-stans eller apoptose på grunn av tap av HDAC1,2 funksjoner. Etter labeling av celler med BrdU, kromatin immunopresipitering (chip) av histon acetylering merkene eller kromatin-remo ble utført med spesifikke antistoffer. BrdU-merkede DNA-inngang og immunpresipitert (eller chiped) DNA ble deretter flekket på en membran ved hjelp av slissen blot teknikken og immobilisert ved hjelp av UV. Mengden av begynnende DNA i hvert spor ble deretter kvantitativt vurdert ved hjelp av Western-analyse med et anti-BrdU-antistoff. Effekten av tap av HDAC1,2 funksjoner på nivåene av nylig syntetiserte DNA-assosiert histon acetylering tegnene og kromatin remo ble deretter bestemt ved å normalisere BrdU-ChIP signal oppnådd fra de behandlede prøvene til kontrollprøvene.
Defekt DNA reparasjon og / eller DNA-replikasjon er en vesentlig årsak til genom ustabilitet, noe som kan føre til celledød. En enkelt ureparert dobbel tråd pause er tilstrekkelig til å forårsake celledød en. Chromatin organisasjonen er forbigående endret under både replikasjon og reparasjon 2,3, og unnlatelse av å opprettholde epigenetisk informasjon i løpet av disse prosessene vil resultere i en trussel mot genom integritet. Tap av HDAC3 eller HDAC1,2 funksjon hindrer S-fase progresjon, DNA replikasjon og reparasjon fører til genotoksisk belastning (DNA skade) og celledød 4-9. Det er derfor en praktisk strategi for å bruke selektive HDAC-inhibitorer for å forstyrre replikasjon, reparasjon og kromatin i kreftceller og føre til DNA-skade, som i sin tur kan stoppe vekst og induserer celledød selektivt i raskt voksende kreftceller.
Under DNA replikasjon, er kromatin raskt demonteres og deretter satt sammen igjen etter DNA duplisering. Nylig synthesized histon H4 acetyleres på K5 og K12 rester (H4K5K12ac) og følgende avsetning på kromatin, blir de raskt deacetyleres av histon deacetylases (HDACs) 10,11. Svikt i cellene for å opprettholde integriteten av nascerende kromatin histon-deacetylering kan føre til kollaps gaffel, som i sin tur kan føre til DNA-skade og celledød. Vi har nylig viste at selektiv hemming av HDAC1,2 øker histon acetylering (H4K5ac, H4K12ac og H4K16ac) og hemmer SMARCA5 kromatin remo aktivitet på begynnende kromatin, som korrelerer med redusert replikasjonsgaffelen progresjon, økt gaffel kollaps og økt replikering stressindusert DNA-skader 6 . Således kan HDAC-inhibitor behandling forandre begynnende kromatinstruktur å utløse DNA-skade og død meget raskt i kreftceller, da disse celler syklusen raskt og passerer flere ganger gjennom S-fasen. Det er derfor viktig å forstå hvordan HDACs fungere å regulere histon acetylering og protein binding for å opprettholde DNA-replikasjon i pattedyrceller.
Å kvantitativt måle mengden av histon acetylering og SMARCA5 kromatin remo assosiert med begynnende DNA ved DNA-replikasjon, har vi utviklet en modifisert ChIP assay kalt BrdU-chip-Slot-vestlig teknikk. Etter kromatin immunoutfelling (chip) for et ønsket protein eller histone modifikasjon, mengden av begynnende DNA (merket ved anvendelse av tymidinanalog, BrdU) i brikken prøve kan påvises ved hjelp av Western-analyse av BrdU-merkede ChIP DNA overført til en membran ved hjelp av en spilleautomat Blot apparat. Ved hjelp av denne teknikken, viste vi at H4K16ac (et merke som er involvert i kromatin emballasje) og ISWI familiemedlem SMARCA5 (SWI / SNF-relaterte matrix-forbundet aktin avhengig regulator av kromatin) kromatin remo er assosiert med begynnende DNA i S-fase celler 6. Vi fant også at den gryende H4K16ac mark deacetyleres av HDAC1,2 under DNA replikasjon 6. H4K16ac hemmerkromatin remo aktivitet av ISWI familiemedlem SMARCA5 12. Derfor bruker BrdU-CHIP-Slot-vestlig teknikk, kunne vi koble funksjonene for HDAC1,2 i regulering kromatin remodelle under DNA replikasjon. Derfor er BrdU-Chip-Slot-Western Blot teknikken en kraftig tilnærming til kvantitativt måle foreningen og dissosiasjon dynamikken i proteiner eller deres post-translasjonelle modifikasjoner som er bundet til begynnende DNA.
Den protokoll som er beskrevet i dette manuskriptet er en relativt rask metode for å demonstrere nærværet av proteiner eller deres post-translasjonelt modifiserte former for nylig replikerte eller begynnende DNA. I tillegg tillater denne teknikken en å måle krets-dissosiasjons-kinetikk av et protein eller dets modifisert form med begynnende DNA. Denne teknikken er komplementær til den elegante iPOND teknologi 13. I iPOND teknologi, er nylig syntetisert DNA merket med etyl deoksyuridin (Edu). En biotinko…
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet i dette manuskriptet ble støttet av midler fra Dept. of Radiation Oncology og Huntsman Cancer Institute og National Institute of Health stipend (R01-CA188520) til SB. Jeg takker Danielle Johnson og Steven Bennett i min lab for å demonstrere protokollen og forklarer dens fordeler. Jeg er takknemlig for Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Cancer Institute) for kritiske kommentarer til manuskriptet.
Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
Rnase A | Qiagen | 19101 | |
Proteinase K | Sigma | P4850 | |
PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Glycine | Sigma | G7403 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
BrdU | Sigma | B9285 | |
Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
NaCl | Sigma | S-3014 | |
Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
NP40 | USB Corporation | 19628 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
Tris | Fisher | BP-152-5 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
SDS | Ambion | AM9820 | |
Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
20X SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |