Быстрый и эффективный метод для очистки эндодермы клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека
Summary
Здесь мы опишем метод очистки дифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека, которые совершаются по отношению к окончательному энтодермы для улучшения последующих применений и дальнейших дифференцировок.
Abstract
Возможности дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) позволяют потенциальное терапевтическое применение для клеточной заместительной терапии. Терминально дифференцированных типов клеток могут быть использованы для лечения различных дегенеративных заболеваний. В пробирке дифференцировки этих клеток по отношению к тканям легких, печени и поджелудочной железы требует в качестве первого шага генерации окончательных эндодермы клеток. Этот шаг является ограничивающим скорость для дальнейшей дифференциации по отношению к неизлечимо созревших типов клеток, таких как инсулин-продуцирующих бета-клеток, гепатоцитов или других эндодермы типов клеток. Клетки, которые совершаются в направлении энтодермы линии высоко выражают множество транскрипционных факторов, таких как Foxa2, SOX17, HNF1B, члены семьи GATA, и поверхностный рецептор CXCR4. Тем не менее, протоколы дифференциации редко эффективны на 100%. Здесь мы опишем метод для очистки популяции CXCR4 + клеток после дифференцировкив ДЭ с использованием магнитных микрогранул. Эта очистка дополнительно удаляет клетки нежелательных линий. Метод нежной очистки является простым и надежным и может быть использовано для улучшения вниз по течению приложений и дифференциацию.
Introduction
Плюрипотентные стволовые клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) обладают способностью дифференцироваться в практически любой тип клеток человеческого организма. Таким образом, экстракорпоральное протоколы дифференцировки могут быть использованы для создания многочисленных типов зрелых клеток , таких как кардиомиоциты 1, гепатоциты 2, бета – клетки, эпителиальные 3 легких 4 или 5 нейрональных клеток. Это делает ESCS ценным инструментом для потенциального лечения различных дегенеративных заболеваний 3.
Дифференциация в пробирке ЭСК в сторону взрослых тканей легких, печени и поджелудочной железы требует псевдо-гаструляции в клетки , напоминающие окончательное энтодермы (DE) 6. Так как ниже по течению дифференциации по отношению к вышеупомянутым типов соматических клеток значительно менее эффективно, оптимальная дифференциация эндодермы рассматривается как ограничивающий скорость 7. Клетки, которые совершаются в направлении энтодермы линии подвергаются тяracteristic изменения в их профиля экспрессии генов. Гены мастер Плюрипотентность регулятора вниз регулируется, тогда как экспрессия других факторов транскрипции , таких как Foxa2, SOX17, HNF1B, членов семейства GATA и поверхностного рецептора CXCR4 высоко активируемых 6, 8, 9. CXCR4 , как известно, трансактивируется по SMAD2 / 3, ниже по потоку Узловое сигнализации / TGF-бета и SOX17 из – за специфических участков связывания в его промоторной области 10. Таким образом , это очень подходит маркер , используемый в ряде докладов 6, 8, 11-13. Эти изменения экспрессии отражает событие псевдо-гаструляции, в которой ЭСК сначала приобрести характеристики первичной полоски типа клеточной популяции , а затем совершить в энтодермы зародышевого слоя 6.
Тем не менее, протоколы дифференциации редко 100% эффективны , как несколько клеток могут сопротивляться процессу дифференциации или дифференциации по отношению к другим непредвиденным родословных 14. Эти клетки могут отрицательно influeсть дальнейшая дифференциация. Кроме того, остаточные недифференцированные клетки питают большие риски для последующих экспериментов по трансплантации и может привести к тератомы 15-17.
Чтобы удалить эти нежелательные клетки на ранней на поверхности маркера CXCR4 может быть использован для очистки клеток, которые совершаются в направлении DE 18. Здесь мы опишем метод позитивного отбора CXCR4 + клеток от дифференциации культур DE. Для этого поверхность маркер CXCR4 связывается с антителом, которое затем, в свою очередь связывается с магнитными микрогранул. В отличие от жестких условий во время FACS сортировки, Магнитно меченых DE-подобные клетки могут затем легко быть очищены в формате стендовых, используя щадящий метод очистки. Этот протокол обеспечивает простой способ удаления клеточных популяций, противоставших процесса дифференцировки DE.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящее время используются протоколы дифференциации редко приводят к 100% дифференцированных клеток. По причинам, которые еще должны быть решены некоторые клетки сопротивляются процесса дифференцировки. В зависимости от эффективности используемого протокола дифференцировки и Ск…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Умелое техническая помощь Jasmin Kresse выражает искреннюю признательность.
Materials
| Hues8 human embryonic stem cell line | Harvard Department of stem cell & regenerative biology | NA | Suitable cell line for endoderm generation |
| Hes3 human embryonic stem cell line | ES Cell International | NA | Suitable and robust cell line for endoderm generation |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | ESC culture medium |
| FCS | Biowest | S1860 | |
| Advanced RPMI 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| CD184 (CXCR4)-APC, human | Miltenyi Biotec | 130-098-357 | |
| anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | magnetic field |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | ROCK inhibitor |
| CHIR-99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Activin A | Peprotech | 120-14 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA |
| Matrigel* | Corning | 354277 | basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately. |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 30-042-201 | |
| MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga |
Life Technologies | NA | |
| Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg |
Life Technologies | NA | |
| SOX17 TaqMan assay | Applied Biosystems | Hs00751752_s1 | |
| Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg |
Life Technologies | NA | |
| Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t |
Life Technologies | NA | |
| Anti-SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17320 | |
| Anti-FOXA2 | MerckMillipore | 07-633 | |
| Anti-SOX17 | R&D Systems | AF1924 | |
| NA = not applicable |
References
- Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P.W., Wu, S.M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
- Sgodda, M., et al. Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells. Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).
- Naujok, O., Burns, C., Jones, P.M., Lenzen, S. Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet? Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).
- Katsirntaki, K., et al. Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).
- Abranches, E., et al. Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo. PLoS One. 4 (7), e6286 (2009).
- Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling. Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).
- D'Amour, K.A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells. Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).
- Kim, P.T., Ong, C.J. Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells. Results Probl Cell Differ. 55 303-319 (2012).
- Katoh, M., Katoh, M. Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors. Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).
- Nostro, M.C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Bruin, J.E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Fu, W., Wang, S.J., Zhou, G.D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W.J. Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).
- Hentze, H., Soong, P.L., Wang, S.T., Phillips, B.W., Putti, T.C., Dunn, N.R. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).
- Herberts, C.A., Kwa, M.S., Hermsen, H.P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9 29 (2011).
- Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment. Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).
- Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W.H., Baker, J.C. A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors. PLoS One. 6 (3), e17536 (2011).
