Un método rápido y eficiente para la purificación de células del endodermo generada a partir de células madre embrionarias humanas
Summary
A continuación, se describe un método para la purificación de células madre embrionarias humanas diferenciadas que están comprometidas hacia el endodermo definitivo para la mejora de las aplicaciones posteriores y otras diferenciaciones.
Abstract
Las capacidades de diferenciación de las células madre pluripotentes tales como células madre embrionarias (CES) permiten que una aplicación terapéutica potencial para las terapias de reemplazo celular. Terminal tipos de células diferenciadas se podrían utilizar para el tratamiento de diversas enfermedades degenerativas. Diferenciación in vitro de estas células hacia los tejidos del pulmón, hígado y páncreas requiere como primera etapa de la generación de células endodérmicas definitivas. Este paso es limitante de la velocidad para su posterior diferenciación hacia tipos de células maduras terminal tales como las células beta productoras de insulina, hepatocitos u otros tipos celulares derivados del endodermo. Las células que se han comprometido hacia el linaje endodermo altamente expresan una multitud de factores de transcripción como FOXA2, SOX17, HNF1B, los miembros de la familia GATA, y el receptor CXCR4 superficie. Sin embargo, rara vez son protocolos de diferenciación 100% de eficiencia. A continuación, describimos un método para la purificación de una población de células CXCR4 + después de la diferenciaciónen la DE mediante el uso de microperlas magnéticas. Esta purificación elimina, además, las células de los linajes no deseados. El método de purificación suave es rápido y fiable, y puede ser utilizado para mejorar las aplicaciones posteriores y diferenciaciones.
Introduction
Las células madre pluripotentes tales como células madre embrionarias (CES) tienen la capacidad de diferenciarse en casi cualquier tipo de célula del cuerpo humano. Por lo tanto, los protocolos de diferenciación in vitro se pueden utilizar para generar numerosos tipos de células de adultos, tales como cardiomiocitos, hepatocitos 1 2, las células beta 3, epitelial de pulmón 4 o células neuronales 5. Esto hace que los CES una herramienta valiosa para el tratamiento potencial de diversas enfermedades degenerativas 3.
La diferenciación in vitro de los CES hacia tejidos adultos del pulmón, hígado y páncreas requiere un pseudo-gastrulación en células que recuerdan el endodermo definitivo (DE) 6. Puesto que la diferenciación de aguas abajo hacia los tipos de células somáticas antes mencionados es significativamente menos eficiente, una diferenciación endodermo óptima se considera como limitante de la velocidad 7. Las células que se han comprometido hacia el linaje endodermo se someten chacaracterísti- cambios en su perfil de expresión génica. Regulador de los genes maestros pluripotencia están regulados hacia abajo, mientras que la expresión de otros factores de transcripción como FOXA2, SOX17, HNF1B, los miembros de la familia GATA y el receptor de la superficie CXCR4 está altamente regulada positivamente 6, 8, 9. CXCR4 es conocido por estar transactivated por SMAD2 / 3, aguas abajo de la señalización nodal / TGF-β y SOX17 debido a los sitios de unión específicos en su región promotora 10. Por lo tanto es un marcador muy adecuado usado en una serie de informes 6, 8, 11-13. Estos cambios en la expresión refleja un evento pseudo-gastrulación, en el que los CES primera adquieren características de una población de células racha similar primitiva y, posteriormente, se comprometen en la capa de germen de endodermo 6.
Sin embargo, los protocolos de diferenciación rara vez son 100% de eficiencia como algunas células pueden resistir el proceso de diferenciación o diferenciar hacia otros linajes no deseados 14. Estas células pueden INFLUE negativamentena vez mayor diferenciación. Además, las células indiferenciadas residuales albergan grandes riesgos para posteriores experimentos de trasplante y pueden dar lugar a teratomas 15-17.
Para eliminar estas células no deseadas se pueden utilizar para la purificación de las células que se han comprometido hacia la DE 18 temprano en el CXCR4 marcador de superficie. A continuación, describimos un método para la selección positiva de células CXCR4 + a partir de cultivos de diferenciación DE. Para ello, el CXCR4 marcador de superficie se une por un anticuerpo que luego a su vez se une a las microperlas magnéticas. A diferencia de las duras condiciones durante FACS clasificación, las células marcadas magnéticamente DE-como pueden ser fácilmente purificados en un formato de sobremesa usando un método de purificación suave. Este protocolo proporciona un método sencillo para la eliminación de poblaciones de células que resistió el proceso de diferenciación DE.
Protocol
Representative Results
Discussion
protocolos de diferenciación Actualmente se utilizan rara vez resultan en células diferenciadas 100%. Por razones que aún no se han abordado algunas células resisten el proceso de diferenciación. Dependiendo de la eficiencia del protocolo de diferenciación usado y de la propensión de la ESC línea A cierto número de células pluripotentes residuales se observa con frecuencia, incluso después de la diferenciación en el endodermo definitivo. Estas células residuales pueden poner en peligro diferenciaciones agua…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La habilidad de asistencia técnica de Jasmin Kresse se agradece.
Materials
| Hues8 human embryonic stem cell line | Harvard Department of stem cell & regenerative biology | NA | Suitable cell line for endoderm generation |
| Hes3 human embryonic stem cell line | ES Cell International | NA | Suitable and robust cell line for endoderm generation |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | ESC culture medium |
| FCS | Biowest | S1860 | |
| Advanced RPMI 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| CD184 (CXCR4)-APC, human | Miltenyi Biotec | 130-098-357 | |
| anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | magnetic field |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | ROCK inhibitor |
| CHIR-99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Activin A | Peprotech | 120-14 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA |
| Matrigel* | Corning | 354277 | basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately. |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 30-042-201 | |
| MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga |
Life Technologies | NA | |
| Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg |
Life Technologies | NA | |
| SOX17 TaqMan assay | Applied Biosystems | Hs00751752_s1 | |
| Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg |
Life Technologies | NA | |
| Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t |
Life Technologies | NA | |
| Anti-SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17320 | |
| Anti-FOXA2 | MerckMillipore | 07-633 | |
| Anti-SOX17 | R&D Systems | AF1924 | |
| NA = not applicable |
References
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