En snabb och effektiv metod för rening av endoderm celler genereras från mänskliga embryonala stamceller
Summary
Här beskriver vi en metod för rening av differentierade stamceller från mänskliga embryon som begås mot den slutgiltiga endoderm för förbättring av tillämpningar i efterföljande led och ytterligare indelningar.
Abstract
Differentieringen kapacitet pluripotenta stamceller som embryonala stamceller (ESC) att en potentiell terapeutisk tillämpning för cellersättningsbehandlingar. Terminalt differentierade celltyper skulle kunna användas för behandling av olika degenerativa sjukdomar. In vitro-differentiering av dessa celler mot vävnader i lunga, lever och pankreas kräver som ett första steg generering av slutgiltiga endodermala celler. Detta steg är hastighetsbegränsande för ytterligare differentiering mot terminalt mognade celltyper såsom insulinproducerande betaceller, hepatocyter eller andra endoderm-härledda celltyper. Celler som begås mot endoderm linjen uttrycker starkt en mängd transkriptionsfaktorer såsom FOXA2, SOX17, HNF1B medlemmar av GATA familjen, och ytreceptor CXCR4. Emellertid differentieringsprotokoll är sällan 100% effektiv. Här beskriver vi en metod för rening av en CXCR4 + cellpopulation efter differentieringi DE med hjälp av magnetiska mikropärlor. Denna rening avlägsnar dessutom celler av oönskade härstamningar. Den milda reningsmetoden är snabb och tillförlitlig och kan användas för att förbättra applikationer och indelningar nedströms.
Introduction
Pluripotenta stamceller t.ex. embryonala stamceller (ESCS) har förmågan att differentiera till praktiskt taget alla celltyper i den mänskliga kroppen. Sålunda kan differentiering in vitro protokollen användas för att generera ett stort antal vuxna celltyper såsom kardiomyocyter 1, hepatocyter 2, betaceller 3, lung epithelial 4 eller neuronala celler 5. Detta gör ekonomiska och sociala råd ett värdefullt verktyg för potentiell behandling av olika degenerativa sjukdomar 3.
In vitro-differentiering av ekonomiska och sociala råd till vuxna vävnader i lungorna, levern och bukspottkörteln kräver en pseudo-gastrulation i celler som påminner om den slutgiltiga endoderm (DE) 6. Eftersom nedströms differentiering mot nämnda somatiska celltyper är betydligt mindre effektiva, är en optimal endoderm differentiering betraktas som hastighetsbegränsande 7. Celler som begås mot endoderm härstamning genomgå characteristic förändringar i deras genuttryck profil. Pluripotens masterregulatorn gener ner reglerad, medan uttrycket av andra transkriptionsfaktorer såsom FOXA2, SOX17, HNF1B medlemmar av GATA familjen och ytreceptor CXCR4 är mycket uppregleras 6, 8, 9. CXCR4 är känt att transaktiveras av Smad2 / 3, nedströms Nodal / TGF-β signalering och SOX17 på grund av specifika bindningsställen i sin promotorregion 10. Det är således en mycket lämplig markör som används i ett antal rapporter 6, 8, 11-13. Dessa uttryck förändringar återspeglar en pseudo-gastrulation händelse, där ekonomiska och sociala råd först förvärva egenskaperna hos en primitivstrimman liknande cellpopulationen och därefter begå i endoderm GRODDBLAD 6.
Men differentieringsprotokoll är sällan 100% effektiv som ett fåtal celler kan motstå differentieringsprocess eller skilja mot andra oavsiktliga linjer 14. Dessa celler kan negativt influeiou ytterligare differentiering. Dessutom kvarvarande odifferentierade celler hyser stora risker för senare transplantation experiment och kan ge upphov till teratom 15-17.
För att avlägsna dessa oönskade celler tidigt på ytan markör CXCR4 kan användas för rening av celler som begås mot DE 18. Här beskriver vi en metod för positiv selektion av CXCR4 + celler från DE differentierings kulturer. För detta är ytan markör CXCR4 bindas av en antikropp, som sedan i sin tur binder till magnetiska mikropärlor. Till skillnad från de svåra förhållandena under FACS-sortering, de magnetiskt märkta DE-liknande celler kan sedan enkelt renas i en bordsformat med användning av en mild reningsmetod. Detta protokoll ger en enkel metod för avlägsnande av cellpopulationer som motstod differentieringsprocessen DE.
Protocol
Representative Results
Discussion
För närvarande används differentieringsprotokoll sällan resulterar i 100% differentierade celler. Av skäl som fortfarande måste lösas vissa celler motstå differentieringsprocessen. Beroende på effektiviteten av den använda differentieringsprotokoll och benägenheten hos ESK linje ett visst antal kvarvarande pluripotenta celler är vanliga även efter differentiering till den slutgiltiga endoderm. Dessa kvarvarande celler kan försämra indelningar nedströms eller ytterligare analys såsom transkriptomik, prot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Skicklig tekniskt bistånd från Jasmin Kresse är tacksamma.
Materials
| Hues8 human embryonic stem cell line | Harvard Department of stem cell & regenerative biology | NA | Suitable cell line for endoderm generation |
| Hes3 human embryonic stem cell line | ES Cell International | NA | Suitable and robust cell line for endoderm generation |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | ESC culture medium |
| FCS | Biowest | S1860 | |
| Advanced RPMI 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| CD184 (CXCR4)-APC, human | Miltenyi Biotec | 130-098-357 | |
| anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | magnetic field |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | ROCK inhibitor |
| CHIR-99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Activin A | Peprotech | 120-14 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA |
| Matrigel* | Corning | 354277 | basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately. |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 30-042-201 | |
| MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga |
Life Technologies | NA | |
| Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg |
Life Technologies | NA | |
| SOX17 TaqMan assay | Applied Biosystems | Hs00751752_s1 | |
| Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg |
Life Technologies | NA | |
| Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t |
Life Technologies | NA | |
| Anti-SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17320 | |
| Anti-FOXA2 | MerckMillipore | 07-633 | |
| Anti-SOX17 | R&D Systems | AF1924 | |
| NA = not applicable |
References
- Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
- Sgodda, M., et al. Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells. Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).
- Naujok, O., Burns, C., Jones, P. M., Lenzen, S. Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet. Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).
- Katsirntaki, K., et al. Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).
- Abranches, E., et al. Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo. PLoS One. 4 (7), e6286 (2009).
- Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling. Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).
- D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells. Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).
- Kim, P. T., Ong, C. J. Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells. Results Probl Cell Differ. 55, 303-319 (2012).
- Katoh, M., Katoh, M. Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors. Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Fu, W., Wang, S. J., Zhou, G. D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W. J. Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).
- Hentze, H., Soong, P. L., Wang, S. T., Phillips, B. W., Putti, T. C., Dunn, N. R. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).
- Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9, 29 (2011).
- Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment. Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).
- Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W. H., Baker, J. C. A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors. PLoS One. 6 (3), 17536 (2011).
