Gradiente de pressão Chip para estimulantes comportamentos celulares em hidrogel de célula-carregado

Summary

Este artigo apresenta uma abordagem simples para fornecer não-contínuo gradientes cepas estáticas em um hidrogel de célula-carregado concêntrico para regular o alinhamento da célula para a engenharia de tecidos.

Abstract

Orientação artificial para alinhamento celular é um tema quente no campo da engenharia de tecidos. A maioria da pesquisa anterior investigou único alinhamento celular induzida por tensão em um hidrogel célula carregada por meio de complexos processos experimentais e massa em sistemas de controlo, que são normalmente associados com problemas de contaminação. Assim, neste artigo, propomos uma abordagem simples para a construção de uma estirpe de estática gradiente usando um chip fluídico com uma tampa plástica de PDMS e um substrato de vidro transparente de UV para a estimulação do comportamento celular em um hidrogel 3D. Pré-polímero de célula foto-patternable sobrecarga na câmara fluídico pode gerar uma membrana PDMS curva convexa na capa. Após a reticulação de UV, através de um micropattern circular concêntrico sob a membrana PDMS curvada e tampão de lavagem, um microambiente para investigar célula comportamentos sob uma variedade de cepas de gradientes é self estabelecida em um único chip fluídico, sem instrumentos externos. NIH3T3 células foram demonstradas após observar a mudança da tendência de alinhamento celular sob orientação de geometria, em cooperação com a estimulação de estirpe, que variou entre 15-65% no hidrogel. Após uma incubação de 3 dias, a geometria de hidrogel dominou o alinhamento da célula sob baixa tensão compressiva, onde células alinhadas ao longo da direção de alongamento de hidrogel sob alta tensão compressiva. Entre estas, as células mostraram alinhamento aleatório devido a dissipação da orientação radical de alongamento de hidrogel e a orientação de geometria do hidrogel estampado.

Introduction

Servindo como um material do bloco que imita um microambiente nativo, um hidrogel contendo a matriz extracelular (ECM) pode re-construir andaimes de tecido biomimético para apoiar o crescimento de células. Para possuir as funções de um tecido, o alinhamento da célula organizada é um requisito essencial. Vários 2D (isto é, células cultivadas sobre uma superfície) e 3D (i.e., células encapsuladas em um hidrogel) alinhamentos de células que foram alcançados pelo cultivo ou encapsular células em ou em substratos flexíveis com micro- ou nano-padrões¹. Alinhamento da célula 3D na microarquitetura é mais atraente, como o microambiente aproxima-se do tecido nativo construção^2,3,4. Uma abordagem comum para alinhamento de célula 3D é o cue geométrico de hidrogel forma^2,3. Por causa do espaço restrito para proliferação celular na direção do eixo curto, células visam alinhar ao longo da direção do eixo longo em um hidrogel micromodelados. Outra abordagem é aplicar o estiramento elástico para o hidrogel para atingir o alinhamento da célula paralelo à direção de estiramento^4,5.

Estimulação biofísica em hidrogel de ECM, tais como tensão compressiva ou um campo elétrico, pode regular funções de células de tecido adequada integração, proliferação e diferenciação^1,2,3. Muita pesquisa tem sido feita para investigar o comportamento celular através da aplicação de uma condição de tensão de cada vez usando múltiplo controle mecânico unidades^4,6,7,8,9. Por exemplo, o uso de motores de passo mecânico espremido ou esticada sobre um hidrogel de colágeno de célula encapsulada 3D tem sido comum uma abordagem^7,10. No entanto, tal equipamento controlador requer espaço extra e enfrenta a questão da contaminação na incubadora^7,9,11,12. Além disso, o grande instrumento não pode dar um ambiente de controle preciso para fornecer grande reprodutibilidade¹³.

Considerando que o hidrogel célula-carregado é normalmente utilizadas na microescala para aplicações biomédicas, é vantajoso combinar técnicas de MEMS para gerar uma gama de tensão/estiramento estimulação para investigar simultaneamente comportamentos de célula em 3D biomimetic construções em vitro^{2,14,15,16,17,18}. Por exemplo, usando a pressão do gás a deformar-se a membrana PDMS em chips microfluídicos pode dar origem a várias cepas, dirigindo a diferenciação celular de linhagens diferentes^9,16. No entanto, existem muitos desafios técnicos, tais como processos de fabricação de chip complicado em um quarto limpo e a integração de software controle de motores, bombas, válvulas e gases comprimidos.

Neste trabalho, vamos demonstrar uma abordagem simples para obter um chip de gradiente estático-estirpe microfluidic auto-sustentável, empregando-se um padrão de hidrogel circulares concêntricos e uma membrana flexível de PDMS. Ao contrário da maioria das abordagens existentes, a nossa plataforma é um dispositivo portátil e descartável em miniatura que podem ser fabricados fora um quarto amarelo e que possui a auto-geração de cepas gradientes em hidrogel concêntricos de célula encapsulada, sem equipamentos mecânicos externos durante a incubação. Comportamentos de células de fibroblastos 3T3 influenciaram por uma combinação de hidrogel forma e uma variedade de pistas de orientação estiramento elástico foram demonstradas durante a observação de alinhamento de célula dentro de ambientes 3D de ECM-mimética no chip gradiente de tensão para 3 dias.

Protocol

1. GelMA Synthesis Weigh 10 g of gelatin powder and add it to a glass flask with 100 mL ofDulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS). Put a magnetic stir bar into the flask and place the flask on a stirring hot plate. Cover the flask with aluminum foil to avoid water evaporation. Set the hot plate temperature to 50-60 °C and the stirrer at 100 rpm for 1 h to dissolve the gelatin powder well. After the gelatin has dissolved, add 8 mL of methacrylic anhydride very slowly (one drop …

Representative Results

Para comparar as variações mecânicas entre cada hidrogel circular no chip estimulação concluído gradiente de tensão, medimos as larguras de linha de cada hidrogel circular em dois dos chips mesmos, com volumes de injeção de 0 µ l (figura 4a) e 40 µ l (figura 4b), respectivamente. Os alongamentos por cento em cada círculo foram calculados dividindo os alongamentos no chip 40 µ l-injetado pelas larguras de linha do hid…

Discussion

Neste trabalho, relatamos sobre uma abordagem simples para comparar o comportamento de alinhamento de célula depois de hidrogel forma de orientação e de estiramento elástico. Uma membrana flexível de PDMS cria uma curvatura em forma de cúpula para a geração de diferentes alturas de hidrogel circulares concêntricos. Após liberar a pressão, a membrana PDMS aplica automaticamente a força para a micromodelados de hidrogel para formar o gradiente de tensão/alongamento, com um máximo no centro e um mínimo no lim…

Materials

1.5-mL black microcentrifuge tube	Argos Technologies	03-391-161	This one can be replaced with a neutral color of 1.5-mL tube covered with aluminun foil
10X DPBS	Sigma-Aldrich	56064C
Alexa Fluor 488 phalloidin	Invitrogen	A12379
BSA	Sigma	A1595
Calcein	Molecular Probe	C1430	For labeling viable cells
CCD	PCO. Imaging	Pixelfly qe
Cell membrane permeating solution	Sigma-Aldrich	X100	0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	Cell nucleus staining
Dialysis membrane	Sigma-Aldrich	D9527	Molecular weight cut-off = 14,000
DMEM	Gibco	11995-065
Double-side tape	3M	8003
FBS	Hyclone	SH30071.03
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2500	gel strength 300, type A, from porcine skin
High frequency electronic corona generator	Electro-technic products	MODEL BD-20
Methacrylic Anhydride	Sigma-Aldrich	276685
Micro syringe	Hamilton	80501	50 μL
Microscope	Olympus	IX71	Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock
Oxygen plasma machine	Harrick plasma	PDC-001
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	For fixing cell
PDMS	DOW CORNING	Sylgard 184	Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication
Pen-Strep	Gibco	10378-016	penicillin/streptomycin
Photoinitiator	CIBA	Irgacure 2959
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170	For labeling dead cells
Sterile Filtration cup	Millipore	SCGPT05RE
TMSPMA	Sigma-Aldrich	440159	For hydrogel immobilization
Ultrasonicator	Delta	D150H	150W, 43kHz
UV light	DAIHAN	WUV-L10
Freeze Dryer	FIRSTEK	150311025
NIH3T3(fibroblast)	Food Industry Research and Development Institute(FIRDI)	08C0011
MOXI Z Mini Automated Cell Counter	ORFLO	MXZ001