Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.
The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon β and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.
عامل النسخ أعرب بتواجد مطلق وجوهري إنترفيرون (IFN) عامل التنظيمي 3 (IRF3) هو أمر حاسم لخط الدفاع الأول ضد مسببات الأمراض أساسا من خلال تحريض IFNβ، ولكن أيضا من خلال تحريض على chemokine (CC عزر) يجند 5 (CCL5 ) والعديد من البروتينات المضادة للفيروسات بما في ذلك البروتين IFN التي يسببها مع tetratricopeptide يكرر IFIT1 / 2/3 1-3. تم الإبلاغ عن تفعيل IRF3 العدوى التالية مع العديد من الفيروسات أو التعرض لحمض polyinosinic-polycytidylic (بولي I: C) أو lipopolysaccharide في (LPS) 4. الأهم من ذلك، تطورت الفيروسات الأكثر دراسة آليات للتهرب من الاستجابة بوساطة IRF3، وبالتالي الهروب من المضيف الدفاع المناعي الفطري 5. وهكذا، ورصد تفعيل IRF3 له أهمية كبيرة لفهم الآليات الجزيئية للالفطري دفاع المضيف المضادة للفيروسات، ولكن أيضا لتحديد استراتيجية تستخدمها الفيروسات للتصدي لهذا الرد.
والأنف والحنجرة "> لكن العديد من التقارير المنشورة لا توفر سوى تحليل محدود من تفعيل IRF3 التي يؤديها رصد تحريض الجينات IRF3 المستهدفة (IFNB1 وIFIT1) و / أو مراسل luciferase الفحص الجيني بالإضافة إلى دقة منخفضة الصوديوم هلام دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS- PAGE) تحليل IRF3. ومع ذلك، العديد من الدراسات البيوكيميائية، ساهمت تحليل سلوك مختلف المسوخ IRF3 وتوضيح هيكل IRF3 الكريستال 11/06 لإثبات أن IRF3 يخضع لمجموعة معقدة من التعديلات بعد متعدية متتابعة من قبل الفسفرة في مواقع متعددة. ويبدو أن مجموعة من الفسفرة المشاركة في تفعيل IRF3 أن تعتمد على التحفيز وعلى الأرجح على نوع من الخلايا. في الخلايا غير المصابة، IRF3 تتعايش كأنواع غير فسفرته وhypophosphorylated تحتوي على phosphoresidues، بما في ذلك Thr135 وSer173، في 1 -198 أأ-N محطة المنطقة 6،12-14. تراكم هذا و hypophosphorylatedهو فعل مكتب إدارة السجلات من IRF3 بواسطة محرضات الإجهاد، وعوامل النمو وعوامل الإضرار DNA 6. الفسفرة من بقايا سر / منتدى المجالس الرومانسية في المنطقة C من محطة IRF3 تحتوي على المجال transactivation يتم تشغيل يتابع تفعيل الفيروسات، بولي I: C أو LPS في نوع الخلية بطريقة تعتمد 15-17. الفسفرة-C النهائي للIRF3 تشمل ما لا يقل عن 7 مواقع phosphoacceptor متميزة نظمت في مجموعتين رئيسيتين، Ser385 / Ser386 وSer396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405، التي تساهم كل لتفعيل IRF3 من خلال dimerization، تراكم النووي، بالتعاون مع CREB -binding البروتين (CBP) / coactivators P300، DNA ملزمة لالإنترفيرون عنصر استجابة حساسة (ISRE) تسلسل التوافق وtransactivation من الجينات المستهدفة 9،10،17-19. ويعتقد الفسفرة Thr390 أيضا للمساهمة في يسببها فيروس تفعيل IRF3 20. تحليل الطيف الكتلي من IRF3 أثبتت أن Ser386، Thr390، Ser396 وSer402 البقايا مباشرة phosphorylatإد من قبل المانع من كيلوبايت كيناز ε (IKKε) / ملزم TANK كيناز 1 (TBK1) تحركات 9،10. مطلوب أيضا الفسفرة في بقايا-C محطة لإنهاء تفعيل IRF3 من خلال polyubiquitination وبوساطة proteasome وتدهور 10. هذه العملية هي أيضا تعتمد على الفسفرة في Ser339، وهو أمر ضروري لتوظيف مزامرة بروبيل PIN1 10،11. وتعتبر الأنواع IRF3 التي تحتوي على ما لا يقل عن الفوسفات-Ser339 / 386/396 بقايا أشكال hyperphosphorylated. يبقى التسلسل الدقيق ووظيفة كل موقع مسألة مناقشة 10،21. فمن الواضح الآن أن IRF3 تنشيط لا يمثل دولة متجانسة، إلا أن الأنواع المختلفة تنشيط اظهار الفسفرة أو dimerization خصائص متميزة موجودة 10،22.لتوفير فهم كامل لتفعيل IRF3 ردا على مسببات الأمراض المحددة، بالتالي فمن الضروري لصفلاaracterize أي من الأنواع تفعيلها والتي يسببها. تحريض الجينات المستهدفة IRF3، IFNB1 وIFIT1، وقد ثبت أن نقدم موثوق للقراءة من أجل تفعيل IRF3. ومع ذلك، ورصد التعبير عن هذه الجينات لا يميز بين الدول التنشيط مختلفة من IRF3. يعتمد تحليل شامل للدول تفعيل IRF3 في وضع معين على توصيف مفصل للالفسفرة وdimerization ضعها 10. Unphosphorylated (النموذج الأول)، hypophosphorylated (النموذج الثاني) وhyperphosphorylated (أشكال الثالث والرابع) أشكال IRF3 6،18،23 يمكن حلها بنجاح من قبل قلة الحركة في قرار عالية من تحليل SDS-PAGE. الأنواع IRF3 أحادى ومثنوي يمكن تحديد كفاءة من خلال تحليل الأم-PAGE. يتم تحسين هذه المناهج إلى حد كبير عندما تستخدم بالاقتران مع الأجسام المضادة الموجهة ضد phosphospecific متميزة المواقع IRF3 phosphoacceptor.
بروتوكولات موحدة تسمح قرار فقيرالبروتينات التي لا يسمح الفصل الفعال للIRF3 متميزة أشكال فسفرته. هنا، نحن تصف بالتفصيل إجراء لتحقيق أعلى دقة لرصد تحريض متميزة الأنواع IRF3 تنشيط الفيروس باستخدام SDS-PAGE بالإضافة إلى الأم-PAGE في تركيبة مع طخة مناعية باستخدام الكلية وphosphospecific الأجسام المضادة. المجراة التمييز بين مختلف تفعيلها يتم تنفيذ أشكال IRF3 على أساس التحولات حراكها لوحظ على SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك، IRF3 مونومر وديمر يمكن تمييزها من قبل الكهربائي غير تغيير طبيعة. الجمع بين هذه التقنيات التكميلية مع اثنين من طخة مناعية يبرهن على أن تكون نهجا بأسعار معقولة وحساسة للحصول على جميع المعلومات اللازمة لإجراء تحليل كامل لتفعيل بوساطة الفسفرة IRF3.
البروتوكول وصفنا هنا يتكون من مزيج من عالية الدقة SDS-PAGE والأم-PAGE بالإضافة إلى استخدام العديد من الأجسام المضادة phosphospecific لتمييز أحادى / مثنوي وphosphoforms I-IV من IRF3. كشف المناسب من هذه الأنواع IRF3 ضروري لتوصيف كامل تفعيل IRF3 في وضع معين. على سبيل المثال، LPS تحفيز الضامة تفعيلها…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37°C bath before use. |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
Trypsin/EDTA 0.25 % | Life Technologies | 25200-072 | |
Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
Hepes | Bioshop | HEP001 | |
Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
EDTA | Bioshop | EDT001 | |
Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20°C. |
p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 % | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
Nitrocellulose membrane (0.45mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
Non-fat dry milk | Carnation | ||
Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw. |
Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20oC. |
Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. |
Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20oC. |
Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20oC. |