Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.
The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon β and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.
Das ubiquitär und konstitutiv exprimierten Transkriptionsfaktors Interferon (IFN) Regulatory Factor 3 (IRF3) ist entscheidend für die erste Linie der Verteidigung gegen Krankheitserreger vor allem durch die Induktion von IFN & beta;, aber auch durch die Induktion des Chemokin (CC motif) Ligand 5 (CCL5 ) und mehrere antivirale Proteine, einschließlich IFN-induzierte Protein mit tetratricopeptide wiederholt IFIT1 / 2/3 1-3. Oder Lipopolysaccharid (LPS) 4: IRF3 Aktivierung wurde nach der Infektion mit einer Vielzahl von Viren, oder durch Einwirkung von Polyinosin-Polycytidylsäure (Poly-I C) angegeben. Wichtig ist, dass die meisten untersuchten Viren Mechanismen entwickelt, um die IRF3 vermittelte Reaktion entziehen und damit die Flucht der Host angeborenen Immunabwehr 5. Somit überwachen IRF3 Aktivierung ist von großer Bedeutung, um die molekularen Mechanismen der unspezifischen antiviralen Abwehr verstehen, sondern auch, um die durch Viren verwendet, um diese Antwort entgegenzuwirken Strategie zu identifizieren.
ent "> Viele veröffentlichten Berichten allerdings nur eine begrenzte Analyse IRF3 Aktivierung durch die Überwachung der IRF3-Zielgen Induktion (IFNB1 und IFIT1) durchgeführt und / oder Luciferase-Reportergen-Assay zu niedrige Auflösung Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gekoppelt ist (SDS- PAGE) -Analyse IRF3. Jedoch zahlreiche biochemische Studien zeigte die Analyse des Verhaltens verschiedener IRF3 Mutanten und Aufklärung der Kristallstruktur IRF3 6-11 haben dazu beigetragen, dass IRF3 herzustellen ist mit einer komplexen Reihe von aufeinanderfolgenden posttranslationalen Modifikationen durch Phosphorylierung an unterworfen mehreren Standorten. Die Menge der Phosphorylierung in IRF3 Aktivierung beteiligt scheint von dem Stimulus und höchstwahrscheinlich nach Zelltyp zu sein. Bei nicht infizierten Zellen, koexistiert IRF3 als nicht-phosphoryliert und hypophosphorylierten enthaltenden Arten phosphoresidues einschließlich Thr135 und Ser173, in der 1 -198 aa N-terminalen Bereich 6,12-14. Anhäufung dieser hypophosphorylierten form der IRF3 durch Stress induzieren, Wachstumsfaktoren und DNA-schädigende Mittel 6 induziert. Phosphorylierung von Ser / Thr-Reste am C-terminalen Region von IRF3 enthaltend die Transaktivierungsdomäne ausgelöst nach einer Aktivierung, die durch Viren, Poly I: C oder LPS in einer zelltypabhängig 15-17. C-terminale Phosphorylierung von IRF3 beinhaltet nicht weniger als 7 verschiedene phosphoacceptor Standorten in zwei Hauptcluster, Ser385 / Ser386 und Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405 organisiert, dass jeder dazu beitragen, IRF3 Aktivierung durch Dimerisierung, Kernakkumulation, Verbindung mit dem CREB bindenden Protein (CBP) / p300 Co-Aktivatoren, DNA-Bindung an sensiblen Antwortelement (ISRE) Konsensus-Sequenzen und Transaktivierung von Zielgenen 9,10,17-19 IFN. Die Phosphorylierung von Thr390 ist auch gedacht, um virusinduzierten IRF3 Aktivierungs 20 beizutragen. Massenspektrometrie-Analysen von IRF3 haben gezeigt, dass Ser386, Thr390, Ser396 und Ser402 Reste direkt phosphorylatdurch den Inhibitor der & kgr; B-Kinase ε (IKKε) ed / TANK-bindenden Kinase 1 (TBK1) Kinasen 9,10. Phosphorylierung an der C-terminalen Reste auch für die Beendigung des IRF3 Aktivierung über Polyubiquitinierung und Proteasom-vermittelten Abbau 10 erforderlich. Dieses Verfahren ist auch abhängig von der Phosphorylierung an Ser339, der für die Einstellung des propyl Isomerase Pin1 10,11 erforderlich ist. IRF3 Spezies, die mindestens Phospho-Ser339 / 386/396 Rückstände berücksichtigt werden hyperphosphorylierten Formen. Der genaue Ablauf und Funktion der Website bleibt eine Frage der Diskussion 10,21. Es ist nun klar, dass aktiviert IRF3 keinen homogenen Zustand dar, sondern dass verschiedene aktivierte Spezies ausgeprägte Phosphorylierung oder Dimerisierung Eigenschaften aufweisen vorhanden 10,22.Um ein vollständiges Verständnis der IRF3 Aktivierung in Reaktion auf bestimmte Krankheitserreger liefern, ist es daher notwendig, characterize welche der aktivierten Spezies induziert werden. Induktion IRF3 Zielgene IFNB1 und IFIT1 hat sich als zuverlässige Auslese für IRF3 Aktivierung. Jedoch Überwachen Expression dieser Gene nicht zwischen verschiedenen Aktivierungszuständen des IRF3 unterscheiden. Eine umfassende Analyse der IRF3 Aktivierungszustände in einer bestimmten Einstellung stützt sich auf die detaillierte Charakterisierung ihrer Phosphorylierung und Dimerisierung Status 10. Unphosphorylierten (Form I), hypophosphoryliert (Form II) und hyperphosphoryliertem (Formen III und IV) IRF3 Formen 6,18,23 erfolgreich durch eingeschränkte Mobilität in hoher Auflösung SDS-PAGE-Analyse aufgelöst werden. Monomeren und dimeren IRF3 Spezies effizient durch native-PAGE-Analyse identifiziert werden. Diese Ansätze werden stark verbessert, wenn es in Kombination mit phosphospecific Antikörper gegen verschiedene IRF3 phosphoacceptor Teilen geleitet verwendet.
Standardprotokolle ermöglichen eine schlechte Auflösung vonProteine, die keine wirksame Trennung von unterschiedlichen IRF3 phosphorylierten Formen zulässt. Hier beschreiben wir im Detail ein Verfahren, um die höchste Auflösung zu erreichen, um die Induktion von verschiedenen Virus-aktivierte IRF3 Spezies unter Verwendung von SDS-PAGE, native-PAGE in Kombination mit Immunoblot gekoppelt mit Gesamt und phosphospecific Antikörper zu überwachen. In vivo Diskriminierung zwischen den Aktiv Formen IRF3 wird auf der Basis ihrer in der SDS-PAGE beobachteten Mobilitätsverschiebungen durchgeführt. Zusätzlich kann IRF3 Monomer und Dimer von nicht-denaturierenden Elektrophorese unterschieden werden. Die Kombination dieser zwei komplementären Techniken mit Immunoblot erweist sich als eine kostengünstige und sensiblen Umgang mit alle notwendigen Informationen für eine vollständige Analyse der Phosphorylierung-vermittelte Aktivierung von IRF3 erwerben.
Das Protokoll beschreiben wir hier aus einer Kombination von hochauflösenden SDS-PAGE und native-PAGE auf die Verwendung von mehreren phosphospecific Antikörper zu den monomeren / dimeren und phosphoforms I-IV IRF3 unterscheiden gekoppelt. Entsprechende Erfassung dieser IRF3 Spezies ist wichtig, um vollständig zu charakterisieren IRF3 Aktivierung in einer bestimmten Umgebung. B. LPS-Stimulierung von aktivierten Makrophagen führt zur Bildung von dimeren, Ser396 / 398 phosphoryliert IRF3 die eine hypophosphorylierten …
The authors have nothing to disclose.
The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37°C bath before use. |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
Trypsin/EDTA 0.25 % | Life Technologies | 25200-072 | |
Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
Hepes | Bioshop | HEP001 | |
Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
EDTA | Bioshop | EDT001 | |
Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20°C. |
p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 % | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
Nitrocellulose membrane (0.45mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
Non-fat dry milk | Carnation | ||
Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw. |
Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20oC. |
Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. |
Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20oC. |
Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20oC. |