एक उच्च संकल्प विधि IRF3 के फोस्फोराइलेशन निर्भर एक्टिवेशन नजर रखने के लिए
Summary
Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.
Abstract
The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon β and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.
Introduction
सर्वत्र और अनिवार्यता से व्यक्त प्रतिलेखन कारक इंटरफेरॉन (IFN) नियामक फैक्टर 3 (IRF3) मुख्य रूप से IFNβ की प्रेरण के माध्यम से रोगजनकों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी केमोकाइन (सीसी मूल भाव) के शामिल ligand 5 (CCL5 के माध्यम से ) और tetratricopeptide साथ IFN प्रेरित प्रोटीन सहित कई एंटीवायरल प्रोटीन IFIT1 / 2 / 01-03 मार्च को दोहराता है। या lipopolysaccharide (एलपीएस) 4: IRF3 सक्रियण polyinosinic-polycytidylic एसिड (सी पाली आई) के लिए निम्न कई वायरस से संक्रमण, या जोखिम की सूचना दी गई है। महत्वपूर्ण बात है, सबसे अधिक अध्ययन वायरस IRF3 की मध्यस्थता प्रतिक्रिया से बचने, और इस तरह मेजबान सहज प्रतिरक्षा रक्षा 5 से बचने के लिए तंत्र विकसित किया है। इस प्रकार, IRF3 सक्रियण की निगरानी जन्मजात एंटीवायरल मेजबान रक्षा के आणविक तंत्र को समझने के लिए, लेकिन यह भी इस प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया करने के लिए वायरस द्वारा इस्तेमाल के लिए रणनीति की पहचान करने के लिए बहुत महत्व का है।
ईएनटी "> कई प्रकाशित रिपोर्ट हालांकि कम संकल्प सोडियम dodecyl सल्फेट जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए युग्मित IRF3-लक्ष्य जीन प्रेरण की निगरानी (IFNB1 और IFIT1) द्वारा किया जाता IRF3 सक्रियण और / या luciferase रिपोर्टर जीन परख का केवल एक सीमित विश्लेषण प्रदान (SDS- पृष्ठ) IRF3 का विश्लेषण। हालांकि, कई जैव रासायनिक अध्ययन, विभिन्न IRF3 म्यूटेंट और IRF3 क्रिस्टल संरचना 6-11 की व्याख्या के व्यवहार के विश्लेषण पर फास्फोरिलीकरण द्वारा अनुक्रमिक बाद translational संशोधनों की एक जटिल सेट के अधीन है कि IRF3 स्थापित करने के लिए योगदान दिया है कई साइटों। IRF3 सक्रियण में शामिल फास्फोरिलीकरण के सेट सेल प्रकार पर प्रोत्साहन पर निर्भर है और सबसे अधिक संभावना प्रतीत होता है। असंक्रमित कोशिकाओं में, IRF3 गैर फॉस्फोरिलेटेड और hypophosphorylated प्रजातियों 1 में, Thr135 और Ser173 सहित phosphoresidues, युक्त के रूप में coexists -198 हूँ एन टर्मिनल क्षेत्र 6,12-14। इस hypophosphorylated च का संचयIRF3 की ORM तनाव inducers, वृद्धि कारक है और डीएनए को नुकसान पहुँचाए एजेंटों 6 से प्रेरित है। Transactivation डोमेन युक्त IRF3 के सी टर्मिनल क्षेत्र में सर्विसेज / Thr अवशेषों के फोस्फोराइलेशन वायरस से हुई सक्रियता शुरू हो रहा है, पाली मैं: एक सेल प्रकार पर निर्भर तरीके 15-17 में सी या एलपी। IRF3 के सी टर्मिनल फास्फोरिलीकरण प्रत्येक dimerization के माध्यम से IRF3 सक्रियण, परमाणु संचय, CREB के साथ सहयोग करने के लिए योगदान है, कि दो मुख्य समूहों, Ser385 / Ser386 और Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405 में संगठित कोई कम से कम 7 अलग phosphoacceptor साइटों शामिल -binding प्रोटीन (सीबीपी) / P300 coactivators, संवेदनशील प्रतिक्रिया तत्व (ISRE) आम सहमति दृश्यों और लक्ष्य जीन 9,10,17-19 की transactivation IFN के लिए बाध्य डीएनए। Thr390 के फोस्फोराइलेशन भी वायरस प्रेरित IRF3 सक्रियण 20 में योगदान करने के लिए सोचा है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री IRF3 का विश्लेषण करती है Ser386, Thr390, Ser396 और Ser402 अवशेष सीधे phosphorylat हैं कि दिखा दिया हैκB काइनेज ε का अवरोध करनेवाला (IKKε) द्वारा एड / टैंक बाध्यकारी काइनेज 1 (TBK1) 9,10 kinases। सी टर्मिनल अवशेषों पर Phosphorylation भी polyubiquitination और एंटीबॉडी की मध्यस्थता गिरावट के माध्यम से 10 IRF3 सक्रियण की समाप्ति के लिए आवश्यक है। इस प्रक्रिया को भी propyl आइसोमेरेस Pin1 10,11 की भर्ती के लिए आवश्यक है जो Ser339 पर फास्फोरिलीकरण, पर निर्भर है। कम से कम phospho-Ser339 / 386/396 अवशेषों से युक्त IRF3 प्रजातियों hyperphosphorylated रूपों माना जाता है। प्रत्येक साइट का सही अनुक्रम और समारोह चर्चा 10,21 का विषय बनी हुई है। यह सक्रिय IRF3 एक सजातीय राज्य का प्रतिनिधित्व नहीं करता है, लेकिन अलग फास्फोरिलीकरण या dimerization विशेषताओं का प्रदर्शन करते है कि अलग अलग सक्रिय प्रजातियों 10,22 मौजूद है कि अब यह स्पष्ट है।विशिष्ट रोगजनक के जवाब में IRF3 सक्रियण की पूरी समझ प्रदान करने के लिए, यह चर्चा के लिए इस प्रकार आवश्यक हैप्रेरित कर रहे हैं सक्रिय प्रजातियों में से जो aracterize। IRF3 लक्ष्य जीन, IFNB1 और IFIT1 की प्रेरण, IRF3 क्रियान्वयन के लिए एक विश्वसनीय पढ़ने के लिए बाहर प्रदान करने के लिए साबित कर दी है। हालांकि, इन जीनों की अभिव्यक्ति की निगरानी IRF3 के विभिन्न सक्रियण राज्यों के बीच भेद नहीं करता। एक विशेष सेटिंग में IRF3 सक्रियण राज्यों के लिए एक व्यापक विश्लेषण इसकी फास्फोरिलीकरण और dimerization स्थिति 10 की विस्तृत लक्षण वर्णन पर निर्भर करता है। Unphosphorylated (प्रपत्र आई), (फार्म द्वितीय) और hyperphosphorylated hypophosphorylated (रूपों तृतीय और चतुर्थ) IRF3 रूपों 6,18,23 सफलतापूर्वक उच्च संकल्प एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण में कम गतिशीलता से सुलझाया जा सकता है। Monomeric और dimeric IRF3 प्रजातियों कुशलता से देशी-पृष्ठ विश्लेषण से पहचाना जा सकता है। अलग IRF3 phosphoacceptor साइटों के खिलाफ निर्देशित phosphospecific एंटीबॉडी के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जब इन तरीकों में काफी सुधार कर रहे हैं।
स्टैंडर्ड प्रोटोकॉल का एक गरीब संकल्प की अनुमति देते हैंअलग IRF3 फॉस्फोरिलेटेड रूपों के कुशल जुदाई की अनुमति नहीं देता है कि प्रोटीन। यहाँ, हम कुल और phosphospecific एंटीबॉडी का उपयोग immunoblot के साथ संयोजन में देशी-पृष्ठ युग्मित एसडीएस पृष्ठ का उपयोग कर अलग वायरस सक्रिय IRF3 प्रजातियों की प्रेरण नजर रखने के लिए उच्चतम संकल्प को प्राप्त करने के लिए विस्तार में एक प्रक्रिया का वर्णन। सक्रिय विभिन्न बीच में विवो भेदभाव IRF3 के रूपों एसडीएस पृष्ठ पर मनाया उनकी गतिशीलता पारियों के आधार पर किया जाता है। इसके अतिरिक्त, IRF3 मोनोमर और डिमर गैर denaturing वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है। immunoblot के साथ इन दो पूरक तकनीक के संयोजन IRF3 के फोस्फोराइलेशन की मध्यस्थता सक्रियता का एक पूरा विश्लेषण के लिए सभी आवश्यक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक किफायती और संवेदनशील दृष्टिकोण साबित होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहाँ वर्णन प्रोटोकॉल IRF3 की dimeric / मोनोमेरिक और phosphoforms मैं-चतुर्थ भेद करने के लिए कई phosphospecific एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए मिलकर उच्च संकल्प एसडीएस पृष्ठ और देशी-पेज का एक संयोजन के होते हैं। इन IRF3 प्रजातियों…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
Materials
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37°C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25 % | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20°C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 % | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20oC. |
References
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