En högupplöst metod för att övervaka Phosphorylation-beroende aktivering av IRF3
Summary
Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.
Abstract
The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon β and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.
Introduction
Den ubiquitously och konstitutivt uttryckt transkriptionsfaktor Interferon (IFN) reglerande faktor 3 (IRF3) är avgörande för den första försvarslinjen mot patogener huvudsakligen genom induktion av IFNp, men också genom induktion av kemokin (CC motiv) ligand 5 (CCL5 ) och flera antivirala proteiner inkluderande IFN-inducerat protein med tetratricopeptide upprepar IFIT1 / 2 / tre från 1 till 3. IRF3 aktivering har rapporterats efter infektion med många virus, eller exponering för polyinosinic-polycytidylsyra (poly I: C) eller lipopolysackarid (LPS) 4. Viktigt har mest studerade virus utvecklat mekanismer för att kringgå IRF3-medierat svar, och därigenom undgå värdens medfödda immunförsvaret 5. Således, övervakning IRF3 aktivering är av stor betydelse för att förstå de molekylära mekanismerna i det medfödda antivirala värdförsvaret, men också för att identifiera den strategi som används av virus för att motverka denna respons.
ent "> Många publicerade rapporter ger dock endast en begränsad analys av IRF3 aktivering utförs av övervakningen av IRF3-målgen induktion (IFNB1 och IFIT1) och / eller luciferas reportergenanalys kopplad till låg upplösning natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS- PAGE) -analys av IRF3. emellertid talrika biokemiska studier, analys av beteendet hos olika IRF3 mutanter och belysning av IRF3 kristallstruktur 6-11 har bidragit till att visa att IRF3 utsätts för en komplex uppsättning av sekventiella posttranslationella modifieringar av fosforylering vid multipla ställen. Uppsättningen av fosforylering involverad i IRF3 aktivering tycks vara beroende av stimulus och troligen på celltypen. I oinfekterade celler, samexisterar IRF3 som icke-fosforylerade och hypofosforylerade arter innehållande phosphoresidues, inklusive Thr135 och Ser173, i en -198 aa N-terminal region 6,12-14. Ansamling av denna hypofosforylerade form av IRF3 induceras genom spännings inducerare, tillväxtfaktorer och DNA-skadande medel 6. Fosforylering av Ser / Thr-rester vid C-terminala regionen av IRF3 innehållande transaktiveringsdomänen utlöses efter aktivering av virus, poly-I: C eller LPS i en cell-typ beroende sätt 15-17. C-terminal fosforylering av IRF3 innebär inte mindre än 7 olika phosphoacceptor platser organiserad i två huvudsakliga grupper, Ser385 / Ser386 och Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, att varje bidrar till IRF3 aktivering genom dimerisering, kärnackumulering, tillsammans med CREB -bindande protein (CBP) / P300 samaktivatorer, DNA-bindning till IFN känsliga svarselement (ISRE) konsensussekvenser och trans av målgener 9,10,17-19. Fosforylering av Thr390 är också tänkt att bidra till virusinducerad IRF3 aktivering 20. Masspektrometri analyser av IRF3 har visat att Ser386, Thr390, Ser396 och Ser402-resterna direkt phosphorylated av hämmare av KB-kinas ε (IKKε) / TANK-bindande kinas 1 (TBK1) kinaser 9,10. Fosforylering vid de C-terminala rester krävs också för terminering av IRF3 aktiveras via polyubiquitinering och proteasom-medierad nedbrytning 10. Denna process är också beroende av fosforylering vid Ser339, vilket är nödvändigt för rekrytering av propyl isomeras Pin1 10,11. IRF3 arter som innehåller åtminstone fosfor-Ser339 / 386/396 rester anses hyperfosforylerat former. Den exakta sekvensen och funktion på varje plats är fortfarande en fråga för diskussion 10,21. Det är nu klart att aktivt IRF3 inte utgör ett homogent tillstånd, men att olika aktiverade arter som uppvisar tydliga fosforylering eller dimeriseringsegenskaper existerar 10,22.För att ge en fullständig förståelse av IRF3 aktivering som svar på specifika patogener, är det således nödvändigt att characterize vilken av de aktiverade ämnen induceras. Induktion av IRF3 målgener, IFNB1 och IFIT1, har visat sig ge en tillförlitlig avläsning för IRF3 aktivering. Men övervakning uttryck av dessa gener skiljer inte mellan olika aktiveringstillstånd IRF3. En omfattande analys av IRF3 aktiveringstillstånd i en viss miljö bygger på detaljerad beskrivning av dess fosforylering och dimeriseringsstatus 10. Ofosforylerad (formulär I), hypofosforylerade (blankett II) och hyperfosforylerat (formulär III och IV) IRF3 former 6,18,23 framgångsrikt kan lösas genom nedsatt rörlighet i hög upplösning SDS-PAGE-analys. Monomera och dimera IRF3 arter kan effektivt identifieras genom nativ-PAGE-analys. Dessa tillvägagångssätt är starkt förbättrad vid användning i kombination med fosfospecifik antikroppar riktade mot distinkta IRF3 phosphoacceptor sajter.
Standardprotokoll tillåta en dålig upplösning avproteiner som inte tillåter effektiv separation av distinkta IRF3 fosforylerade former. Här beskriver vi i detalj ett förfarande för att uppnå den högsta upplösningen för att övervaka induktion distinkta virus aktiverat IRF3 som använder SDS-PAGE kopplad till nativ-PAGE i kombination med immunoblot med användning av totalt och fosfospecifik antikroppar. In vivo diskriminering mellan de olika aktiverade former av IRF3 utförs baserat på deras rörlighetsskiftningar som observerats på SDS-PAGE. Dessutom kan IRF3 monomer och dimer särskiljas genom icke-denaturering elektrofores. Kombinationen av dessa två kompletterande tekniker med immunoblot visar sig vara ett prisvärt och känslig metod för att skaffa all information som behövs för en fullständig analys av fosforylering-medierad aktivering av IRF3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som vi beskriver här består av en kombination av hög upplösning SDS-PAGE och nativ-PAGE kopplad till användningen av flera fosfospecifik antikroppar för att särskilja den monomera / dimera och phosphoforms I-IV i IRF3. Lämplig detektering av dessa IRF3 arter är avgörande för att fullständigt karaktärisera IRF3 aktivering i en specifik inställning. Exempelvis LPS-stimulering av aktiverade makrofager leder till bildning av dimer, Ser396 / 398 fosforylerade IRF3 som uppvisar en hypofosforylerade (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
Materials
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37°C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25 % | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20°C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 % | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20oC. |
References
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
- Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
- Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
- Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
- Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
- Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
- Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
- Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
- Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
- Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
- Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
- Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
- Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
- Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
- Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).
- Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
- Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
- Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
- Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
- Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
- Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
- McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O’Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
- Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).
- Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
- Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
- Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).
