Summary
我々は、分離、表現型の特徴およびマウス歯肉からの免疫細胞の機能解析のための手法を確立しました。
Introduction
歯肉組織は、ヒトおよびマウスの歯列を囲み、常に歯 1の複雑なバイオフィルムにさらされています。歯肉障壁をポリシング免疫細胞ネットワークは、組織の完全性を維持するローカル共生微生物に恒常性を確保し、同時に、病原性のチャレンジ2に対して有効な免疫を提供するために不可欠です。恒常性を達成するために、免疫系を注意深くまだ少し詳細は歯肉の免疫細胞集団および組織免疫2の維持における役割の知られている高度に特化した免疫細胞ネットワークを作成歯肉環境に合わせて調整されます。
免疫恒常性が歯肉に破壊される場合には、いずれかの増加ホスト感受性および/ またはdysbiotic微生物群集、炎症状態の存在を通して、歯周炎は、3〜4を発生します。歯周炎は、歯の喪失につながる、一般的な炎症性疾患でありますupporting構造。その重篤な形態では、一般集団5の約10％に見られます。歯周炎感受性および進行に関与する重要な要因を解剖すると6困難であることが判明しました。しかし、動物モデルは、歯周炎の開始および進行7のメカニズムを理解する上で極めて有用でした。モデルは、免疫ホメオスタシスおよび歯周炎の駆動開発を維持するために不可欠な重要な細胞集団および分子メディエーターを定義するために使用することができます。このような洞察は、免疫恒常性の歯肉固有の制御の我々の理解を変換し、疾患の病因の我々の現在の理解を促進します。
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Protocol
このプロトコルに記載されている全ての実験手順は、必要なガイドラインに従い、施設内動物管理使用委員会、NIDCR / NIHによって承認されました。
1.事前に準備
- 完全培地を調製する：RPMIは2mM L-グルタミン、100単位/ mlのペニシリン、100μgの/ mlストレプトマイシン、10％FBSを補充しました。
- 7.5μgのDNA分解酵素を添加したRPMI培地50ミリリットル（、新鮮なメイク常に氷上に保つ）：DNアーゼメディアを準備します。
- DNアーゼメディアプラス3.2ミリグラム/コラゲナーゼIV型のミリリットルの5ミリリットル（、新鮮なメイク常に氷上に保つ）：コラゲナーゼ-DNアーゼメディアを準備します。
- 前クールFACS緩衝液：PBSで希釈した0.5％FBS。
- 4℃に予冷遠心分離機。
- 37°Cまでのウォームシェーカーインキュベーター。
歯肉ブロックから2単離、解剖、および細胞単離
- ARACガイドラインに従って、適切なチャンバ内のCO 2にそれらを暴露することによって、マウスを安楽死させます。 <李>は、心臓や内臓を露出するために胸部と腹腔を開きます。灌流するために、下大静脈内の切開を行い、27 G針で3ミリリットル注射器を用いて左心室を経てPBSの3ミリリットルを灌流。
- 上を向いて胃とパッド上でマウスの体と頭を固定化します。
- 下にある組織と筋肉を露出させ、下顎と首の領域を覆う皮膚を分離し、はさみで首に向かって唇の各交連をカット。下顎を発見するために下唇を解剖。
- 下顎の両側を分離し、口腔にアクセスするためのそれぞれの側を固定する下側切歯間で切断。
- 離れて鼻腔から口蓋を視覚化し、解剖。
- 10ブレードを使用して領域を解剖し、周囲の歯肉（ 図1）で上顎と下顎臼歯の領域を含みます。縦切開はちょうど第一大臼歯と後部第三大臼歯にとの水平切開部に前方ください歯肉の境界線（組織周囲の歯のホワイトカラー）。
- 5ミリリットルコラゲナーゼ/ DNアーゼ（氷上で保持）で50ミリリットルコニカルチューブに上顎と下顎のブロックを配置します。
- 37℃で1時間振とうインキュベーター中でインキュベートし、インキュベーションの最後の5分間に0.5 M EDTA50μlのを追加します。
- 組織と50ミリリットルチューブに冷たいアーゼメディアの5ミリリットルを加え、穏やかに混合することが渦巻きます。
- シャーレ上の組織の4ブロックを転送し、DNアーゼメディア500μlのでカバー。手術用メスの刃を使用して、組織の各ブロックから歯肉を削除し、歯肉と歯間の領域に刃を向けます。
- セルストレーナー（70μmの大きさ）を介して新しい50mlチューブに、ペトリ皿だけでなく、解剖時に使用される前のDNアーゼメディアから組織やメディアを転送します。使用される機器のすべてとフィルタDNアーゼメディア（3-5 ml）で洗浄します。
- 無菌の3ミリリットルシリンジのプランジャーを使用して、ストレーナに対して組織をマッシュ、冷たいDNアーゼメディア（30〜35 ml）でフィルタリングします。
- 冷たいDNアーゼメディアを持つセルストレーナーを洗浄します。
- 4°C、6分間、314×gで遠心分離します。
- 上清を捨て、完全培地1ml中に再懸濁します。
- 自動細胞計数器を用いて、（予想量が> 80％の生存率で1.2×10 6細胞に8×10 5の範囲とすべきである）細胞を数えます。
歯肉細胞の3刺激およびFACS染色
- ブレフェルジンAの1μL/ mlの存在下でPMA（50ng / ml）およびイオノマイシン（2.5μgの/ ml）で単一細胞懸濁液を刺激
- 37℃で3.5時間、5％CO 2インキュベートします。
- スピンダウンし、4℃でPBSと遠心機で洗います。 6分間314×gで。
- 製造業者の説明書に従って生存能力染色を用いて細胞を染色します。
- 細胞外マーカー（CD45、TCRγδ、TCRβ、CD4、CD8、TCRγδまたはアリ用ステイン製造者の指示に従って、選択したibodies）。
- 4°C、5分間、314×gでの冷FACS緩衝液および遠心分離で細胞を洗浄。
- 静かに細胞ペレットを破壊するためにボルテックス。
- 室温で20分間、2％パラホルムアルデヒドで細胞を固定してください。
- 冷たいFACS緩衝液、4°C、細胞内サイトカインのための5分および染色のための314×gで遠心分離で細胞を洗浄。
- 4°C、5分間、314×gでFACS緩衝液および遠心機で希釈し、冷0.5％サポニンの溶液でFACSチューブを埋めます。
- FACSチューブに0.5％サポニン溶液の300μl加え、4℃で暗所で15分間インキュベートし、その後、4℃、5分間、314×gで遠心します。
- 製造者の指示に従って、細胞内のマーカー（IL-17AおよびIFNγまたは選択のサイトカイン）のための細胞を染色。 4°C、5分間、314×gで0.5％サポニン溶液と遠心で細胞を洗浄。
- FACSで再び洗浄バッファと4℃、5分間、314×gで遠心。
- FACS緩衝液300μlの中で細胞を再懸濁します。
- フローサイトメーター上の結果を分析します。
4.フローサイトメトリー分析
- 細胞を可視化するデブリを排除するために、前方（FSC）および側方散乱（SCC）及びゲートに分析されます。
- 高さ（FSC-H）パラメータ対前方散乱面積（FSC-A）を持つ単一のセルを選択します。
- さらなる分析（ 図2A および 2C）は造血マーカーCD45の+ライブ（生存能力染色によって示されるように）正あるゲート細胞。
- 図 2と図 3に示すように、特定のマーカーの解析を続けます。
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Representative Results
プロトコルの適用を説明するために、我々は（ - / - 、 図2A - C LFA対WT）とし、歯周炎のないマウスの歯肉における免疫細胞のネットワークを調べる代表的な結果を示しています。代表的FACSプロットは、歯肉（ 図2A、2C）でのライブCD45 +造血細胞を示します。このプロトコルで免疫細胞の単離および処理は 、ex vivoで刺激し、サイトカイン分泌パターンの特徴付けを行うために十分な細胞が得られます。ここでは、定常状態（WT）の総CD45 +細胞でIL-17およびIFN-γ染色を示し、マウスでは（ 図2B - D）（によるLFA欠乏に）歯周炎を呈します。これらのデータは、組織の定常状態（WT）の間とローカル歯（ - / - LFA）との関連でサイトカインプロフィールを捕捉するために、この技術の可能性を明らかにする。マイクでeは歯周炎の影響を受けやすく、私たちはさらに、特にT細胞および先天性リンパ系細胞（ILC）の区画（ - B 図3A）の歯肉の免疫細胞組成物を特徴とします。我々は、TCRβ+ CD4 + T細胞内IL-17およびIFN-γの産生を規定することができた、TCRβ+ CD8 + T細胞、TCRγδ+ T細胞、NKおよびILC区画（ 図3C）。
図1：マウス歯肉の単離上顎に解剖のボーダーを実証イラストレーションと歯肉組織切開のために使用される、単離された歯肉セグメント。 （B）ブロック解剖および単離されたブロックのアウトラインを持つマウス上顎（モルエリア）のセグメント。歯肉と上顎臼歯セグメントのヘマトキシリンおよびエオシン染色（H＆E） Lロー（C）に示されて概説組織及び（D）における高倍率。オリジナルの倍率を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：歯肉細胞からのサイトカイン産生のための代表的なFACSデータ 。 （A - C）WT及びLFAにおけるPMAおよびイオノマイシンでのex vivoでの再刺激後のマウス歯肉細胞調製物中の生CD45 +細胞のためのゲートを示すFACSプロット- / - 。 （B - D）歯周なし/でマウスの歯肉からの総CD45 +細胞のマウスにおけるIFN-γおよびIL-17染色を示す代表的FACSプロット（によるLFA-欠乏）。ジル/ ftp_upload / 53736 / 53736fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：炎症を起こした歯肉における免疫集団によるサイトカイン産生 CD45 +細胞にゲートTCRγδ対TCRβのための染色を示す（A）代表FACSプロット。 TCRβ+細胞上でゲーティング、中央のプロットは、TCRβ染色対CD4は（TCRβ+ CD4 + T細胞、TCRβ+ CD8 + T細胞およびTCRγδ+ T細胞の分析を可能にする）を示しています。 TCRγδ - - TCRβのゲーティングセルは、右側のプロットは、NK1.1染色（NK細胞の分析を可能にする）に対するCD45を示しています。 （B）CD90.2のための染色を示す代表的FACSプロットがCD45 +系統陰性細胞にゲート（CD3- CD19 -先天性リンパ系細胞を識別する） - NK1.1 -のCD11c -のCD11b - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TCRβ。細胞集団におけるIFN-γおよびIL-17染色を示す（C）代表的FACSプロットは、識別されました。歯肉製剤は20週齢のLFAからのものである- / -歯周炎を発症したマウス。データは、3つの独立した実験の代表例である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
現在の技術では、成功した表現型の特徴付けのためだけでなく、ex vivoでの機能研究のためだけではなく、適切な（シングルマウスからの）免疫細胞の多数をもたらします。別のグループは、以前に分離し、マウスの歯肉の免疫細胞を特徴付けるためのプロトコルを公開し、動物モデル9における歯周炎の研究で、フローサイトメトリー多色を使用しての値を導入していました。このプロトコルでキー変更のトラブルシューティング、かなり後には歯肉襟エリアと歯間歯肉（ 図1）の両方が含まれるために、組織の全体ブロックの解剖を含めることでした。単独で、歯肉切開して、多くの場合、全層フラップが達成されないと歯肉の一部は、特に歯間地域でミスしました。このアプローチを使用して、収集した免疫細胞の数が大幅に増加しています。また、この手法は、歯肉組織の最適な分離のために、両方の上顎anから可能にD下顎。
このプロトコルの重要なステップは、歯肉領域の保守的な解剖と解剖の効率的なレートが含まれます。具体的には、組織のブロックは、最小限の歯の周りの組織（歯肉）とない口腔内の組織を含むように解剖されるべきです。ブロックを迅速に解剖されるべきであり、組織や細胞は、最適な細胞生存率を確保するために氷の上に残っている必要があります。
トラブルシューティングの目的のために、細胞の低収率はコラゲナーゼ、コラゲナーゼおよび/または組織ブロックから歯肉の不十分な解剖の不適切な濃度でのインキュベーションの不適切な時間に関連させることができることに留意することが重要です。そのノートでは、拡大ルーペ（2X-6X）を使用して、歯肉の切開は役立つことがあります。細胞の低生存率は手順で、氷上に継続的に残っていないメディア、緩衝液及び細胞への遅刻に関連させることができます。
組織DISの種類に固有のこのプロトコルの制限、sectedより大きな組織が利用可能である、他の解剖学的障壁サイトと比較して、歯肉組織の大きさは、（例：皮膚や消化管）を研究しています。
/ - -自然に歯周炎を開発したモデルとはいえ、ここで紹介するテクニックは、私たちがLFAで支配的な細胞集団を特徴付けることができました。 LFAで- / -マウスは、我々は、歯周炎10の開発中に支配的なIL-17サイトカインの署名を同定しました。多色フローサイトメトリー分析を用いて、我々は、IL-17 11の細胞のソースを定義することができました。 IL-17を設定し、この疾患における歯肉10内でローカルにTCRγδT細胞、CD4 + T細胞および先天性リンパ系細胞（ILC）で作製しました。
この方法論と小さな亜集団を同定する能力を用いて単離された細胞のかなりの数で、今、包括的なが理解開発することが可能となります歯肉障壁の完全性を保護する特殊な免疫細胞ネットワークのING。この重要な洞察は、私たちは歯肉環境において免疫応答を評価することができます。この技術を採用することにより、我々は今、追加分析および特徴付けを行うことを可能にする、フローサイトメトリー細胞選別によって歯肉免疫細胞のネットワークの特定の成分を単離するために進むことができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27 G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3 ml |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 ml FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
- Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
- Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. , (2015).
- Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
- Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
- Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).
