Summary
Biz izolasyon, fenotipik karakterizasyonu ve kemirgen dişetinin gelen bağışıklık hücrelerinin fonksiyonel analiz için bir teknik kurduk.
Introduction
Gingival dokusu, insan ve murin diş yapısına çevreleyen sürekli diş 1 kompleks biyofilm maruz kalmaktadır. Dişeti bariyeri polislik bağışıklık hücre ağı patojenik meydan 2 karşı etkili bağışıklık sağlayan, aynı zamanda, doku bütünlüğünü korumak, yerel ortakçı mikroplarla homeostazisini sağlanması ve hayati önem taşımaktadır. Homeostazı elde etmek için, bağışıklık sistemi dikkatlice henüz küçük ayrıntı dişeti bağışıklık hücre popülasyonlarının ve doku bağışıklığı 2 korunmasında rolleri bilinen bir yüksek ihtisas bağışıklık hücre ağı oluşturma dişeti çevre için hazırlanmıştır.
Immün homeostasisin gingiva de bozulduğu zaman, ya da daha büyük bir konakçı karşı duyarlılık ve / veya disbiyotik mikrobiyal topluluklar, enflamatuar bir durumun varlığı sayesinde, periodontit 3 4 ortaya çıkar. Periodontitis diş s kaybına yol açan yaygın bir inflamatuar bir hastalıktıraltlık yapılar. Onun ağır formlarında genel nüfusun 5 yaklaşık% 10'unda görülür. Periodontitis duyarlılık ve ilerlemesinde rol önemli faktörler Kesme 6 zor olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, hayvan modelleri periodontitis başlangıcında ve ilerlemesinde 7 mekanizmalarını anlamak son derece yararlı olmuştur. Modeller bağışıklık homeostazı ve periodontitis sürücü gelişimini sürdürmek için hayati önem taşımaktadır anahtar hücre popülasyonlarının ve moleküler mediatörler tanımlamak için kullanılabilir. Böyle bir anlayış bağışıklık homeostazı dişeti özgü kontrol anlayışımızı dönüşümü ve hastalık patogenezinde güncel anlamanız açısından çok önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol açıklanan tüm deneysel prosedürleri gerekli kurallar takip ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi, NIDCR / NIH tarafından kabul edildi.
1. Peşin hazırlayın
- Tam ortam hazırlayın: RPMI 2 mM L-glutamin, 100 birim / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve% 10 FBS ile takviye edilmiştir.
- 7.5 ug DNaz ile desteklenmiş RPMI medya 50 ml (taze olun her zaman buz üzerinde tutmak): DNase ortamını hazırlayın.
- DNaz medya artı 3.2 mg / kollajenaz Tipi IV ml 5 ml (taze olun her zaman buz üzerinde tutmak): kollajenaz-DNAse ortamı hazırlayın.
- Ön-serin FACS tamponu: PBS içinde seyreltilmiş% 0.5 FBS.
- 4 ° C'ye ön-serin santrifüj.
- 37 ° C'ye ısınmaya çalkalayıcı inkübatör.
Dişeti Blokları 2. İzolasyon, Diseksiyon ve Hücre İzolasyonu
- ARAC kurallarına göre uygun bir odasında CO 2 onları teşhir ederek fareler Euthanize. <li> kalp ve iç organları ortaya çıkarmak için göğüs ve karın boşluğu açın. serpmek için, inferior vena kava bir kesi yapmak ve bir 27 G iğne ile 3 ml şırınga kullanarak sol karıncığın yoluyla PBS 3 ml serpmek.
- yukarı bakacak şekilde mide ile bir pad üzerinde vücut ve fare kafasını hareketsiz.
- altta yatan dokuları ve kasları açığa mandibula ve boyun bölgesini kapsayan cilt ayıran, makasla boyuna doğru dudak her komissura kesin. mandibulayı ortaya çıkarmak için alt dudak teşrih.
- alt ön dişlerin arasına Cut mandibula her iki tarafını ayrı ve ağız boşluğu erişmek için her tarafı hareketsiz hale getirmek.
- Görselleştirmek ve uzak burun boşluğundan damak teşrih.
- 10 bıçak kullanarak alanları incelemek ve dişeti (Şekil 1) çevreleyen maksiller ve mandibular molar alanları bulunmaktadır. Dikey kesiler sadece birinci molar ve posterior üçüncü molar ve yatay kesi de için ön yapmakDişeti sınır (doku çevreleyen diş beyaz yaka).
- 5 ml kollajenaz / DNaz (buz üzerinde tutmak) ile 50 ml konik tüp içinde çene ve alt çene blok yerleştirin.
- 1 saat boyunca 37 ° C'de çalkalamalı bir inkübatör içinde inkübe ve inkübasyon son 5 dakika boyunca 0.5 M EDTA, 50 ul ekle.
- dokular ile 50 ml tüp soğuk DNaz medya 5 ml ekleyin ve hafifçe karıştırın girdap.
- petri üzerinde doku 4 blok aktarın ve DNaz medya 500 ul ile kaplayın. Bir neşter bıçak kullanarak ve dişeti ve diş arası alanlara bıçak işaret ederek, doku her bloğunun gingiva çıkarın.
- hücre süzgeç (70 mikron boyut) ile yeni bir 50 ml tüp, petri yanı sıra diseksiyonu sırasında kullanılan önceki DNaz medyadan dokuları ve medya aktarın. DNaz medya (3-5 ml) kullanılan araçların ve filtrenin tüm yıkayın.
- steril 3 ml şırınga pistonu kullanarak, süzgecin karşı doku püreSoğuk DNase medya (30 ila 35 ml) ile filtreleme.
- Soğuk DNaz medya ile hücre süzgeç yıkayın.
- 4 ° C'de santrifüj, 6 dakika boyunca 314 x g.
- supernatant atmak eksiksiz bir medya 1 ml yeniden askıya.
- Hücreleri saymak otomatik hücre sayacı kullanılarak (beklenen miktar>% 80 canlılığı ile 6 10 x 1,2-5 10 x 8 arasındaki hücreleri arasında olmalıdır).
Dişeti Hücrelerinin 3. stimülasyonu ve FACS Boyama
- Brefeldin A 1 ul / ml varlığında PMA (50 ng / ml) ve iyonomisin (2.5 ug / ml) ile tek bir hücre süspansiyonu teşvik
- 37 ° C de 3.5 saat ve% 5 CO2 inkübe edin.
- Spin ve 4 ° C'de PBS ve santrifüj ile yıkayın; 6 dakika 314 x g.
- Üreticinin talimatlarına göre bir canlılık leke kullanarak hücreleri leke.
- dışı belirteçleri (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ veya karınca için Lekeüreticinin talimatlarına aşağıdaki seçim ibodies).
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 314 xg'de soğuk FACS tamponu ve santrifüj ile hücreler yıkanır.
- Yavaşça hücre pelletini bozmaya girdap.
- Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 2 paraformaldehid hücreleri saptamak.
- 4 ° C'de, hücre içi sitokin 5 dakika ve leke 314 xg'de soğuk FACS tamponu, santrifüj ile hücreler yıkanır.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 314 xg'de FACS tamponu ve santrifüj içinde seyreltilmiş, soğuk% 0.5 saponin çözeltisi ile FACS tüpler doldurun.
- FACS tüpler% 0.5 saponin çözeltisi 300 ul ekle, 4 ° C de karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edilir ve daha sonra 4 ° C'de 5 dakika boyunca 314 x g'de santrifüj.
- imalatçının talimatlarına uygun olarak hücre içi işaretleri (IL-17A ve IFNy ya da tercih edilen sitokinler) için hücrelerin lekelenmesi. 5 dakika boyunca, 4 ° C'de 314 xg% 0.5 saponin çözeltisi ve santrifüj ile hücreler yıkanır.
- FACS ile tekrar yıkayıntampon ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 314 x g'de santrifüjleyin.
- FACS tampon 300 ul hücrelerin yeniden askıya.
- Bir Akış sitometresindeki sonuçlarını analiz.
4. Akım Sitometri Analizi
- hücrelerin görselleştirmek enkaz dışlamak için ileri (FSC) ve yan dağılım (SCC) ve kapısı üzerinde analiz edilecek.
- yüksekliği (FSC-H) parametreleri vs ileri dağılım alanı (FSC-A) Tek hücreleri seçin.
- Daha fazla analiz (Şekil 2A ve 2C) için hematopoietik işaretleyici CD45 + için canlı (geçerlilik boyaması ile gösterildiği gibi) ve pozitif olan kapı hücreleri.
- Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterildiği gibi, özel markörlerin analizi devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
(- / - Şekil 2A - C LFA vs WT) protokolünün uygulanmasını göstermek için, bağışıklık hücresi ile ve periodontitis olmayan farelerin dişetinde ağı inceleyen temsili sonuçlar göstermektedir. Temsilcisi FACS araziler dişeti (Şekil 2A, 2C) canlı CD45 + hematopoetik hücreler gösterir. Bu protokol ile bağışıklık hücrelerinin izolasyonu ve işleme ex vivo uyarılması ve sitokin salgı desen karakterizasyonu gerçekleştirmek için yeterli hücreleri verir. Burada kararlı durumda (WT) toplam CD45 + hücrelerde IL-17 ve IFN-γ boyama göstermek ve farelerde (Şekil 2B - D) (nedeniyle LFA eksikliği) periodontitis gösteren. Bu veriler doku kararlı durum (WT) sırasında ve yerel periodontitis bağlamında sitokin profilleri yakalamak için bu tekniğin potansiyelini ortaya (LFA - / -). mikrofone periodontitis duyarlı biz daha fazla özellikle T hücresi ve Doğuştan Lenfoid hücre (LAK) bölmeleri (- B Şekil 3A) dişeti bağışıklık hücre kompozisyon ile karakterize edilir. Bu TCRβ + CD4 + T hücre içinde, IL-17 ve IFN-y üretimini tanımlamak mümkün, TCRβ + CD8 + T hücresi, TCRγδ + T hücresi, NK ve LAK bölmelerin (Şekil 3C).
Şekil 1:. Maksilla ve izole dişeti segmentinde diseksiyon yatılı gösteren fare dişeti izolasyonu İllüstrasyon dişeti dokusu diseksiyon için kullanılacak. Blok diseksiyonu ve izole blok için anahat ile fare maksilla (molar alan) (B) Bölüm. dişetinin ile maksiller molar segment Hematoksilen ve Eosin leke (H & E) l düşük (C) gösterilir özetlenen dokular ve (D) yüksek büyütme. Orijinal büyütme belirtti. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: diş eti hücrelerinden sitokin üretimi Örnek FACS verileri. (A - C) FACS arsa PMA ile ex vivo olarak yeniden uyarılmasını takiben fare dişeti hücre hazırlıkları canlı CD45 + hücreler için kapısı gösteren ve WT ve LFA içinde iyonomisin - / -. (B - D) (nedeniyle LFA-eksikliğine) periodontitis olan / olmayan farelerin dişeti toplam CD45 + hücreler farelerde IFN-y ve IL-17 boyama gösteren Temsilcisi FACS araziler.iles / ftp_upload / 53736 / 53736fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. TCRγδ CD45 + hücreleri üzerinde kapılı karşı iltihaplı dişeti bağışıklık nüfus tarafından sitokin üretimi (A) Temsilcisi FACS arsa TCRβ için boyama gösteren. TCRβ + hücreleri üzerinde kapılama orta arsa TCRβ boyama karşı CD4 (TCRβ + CD4 + T hücreleri, TCRβ +, CD8 + T hücreleri ve TCRγδ + T hücre analizi sağlar) göstermektedir. TCRγδ - - TCRβ yolluk hücrelerinin sağ arsa NK1.1 boyama (NK hücreleri analiz sağlar) karşı CD45 gösterir. (B) CD90.2 için boyama gösteren Temsilcisi FACS arsa CD45 + soy negatif hücreleri üzerinde kapılı (CD3- CD 19 - NK1.1 - CD11c - CD11b - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TCRβ -) ya sahip doğuştan lenfoid hücreleri tanımlar. (C) tespit hücre popülasyonlarında IFN-y ve IL-17 boyama gösteren Temsilcisi FACS araziler. Dişeti hazırlıkları 20 haftalık LFA vardır - / - periodontitis geliştirmek fareler; Veri üç bağımsız deneyler temsilcisi vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut teknik, başarılı bir şekilde uygun bir (tek bir fare), bağışıklık hücrelerinin büyük sayısını verir, sadece fenotipik karakterizasyon için değil, aynı zamanda fonksiyonel çalışmalar için ex vivo. Başka bir grup daha önce izole ve fare dişeti bağışıklık hücreleri karakterize bir protokol yayınlamıştır ve hayvan modellerinde 9 periodontitis çalışmada flow sitometri çok renkli kullanarak değerini tanıştırmıştı. Önemli sorun giderme Bu protokolde anahtar değişiklik aşağıdaki dişeti yaka alanları ve diş arası gingiva (Şekil 1) hem de dahil etmek için doku tüm blokların diseksiyon dahil oldu. yalnız dişeti diseksiyonu, genellikle tam kalınlık flep elde edilmez ve dişetinin parçası özellikle diş arası alanlarda cevapsız. Bu yaklaşımı kullanarak, toplanan immün hücre sayısı önemli ölçüde artmıştır. Bu teknik aynı zamanda dişeti dokuları maksilla An hem optimum izolasyon sağlard mandibula.
Bu protokol için kritik adımlar dişeti alanların muhafazakar diseksiyon ve diseksiyon verimli bir oran sayılabilir. Özellikle, doku blokları dişleri (dişeti) etrafında sadece minimal doku ve yanak dokuları içerecek şekilde disseke edilmelidir. Bloklar hızla disseke edilmeli ve doku ve hücreler optimum hücre canlılığı sağlamak için buz üzerinde kalmalıdır.
giderme amacıyla hücrelerin düşük verimli kolajenaz, kolajenaz ve / veya doku blokları gingiva yetersiz diseksiyon uygun konsantrasyonları ile inkübe yetersiz süre ile ilişkili olduğunu not etmek önemlidir. Bu kayda göre, dişeti kullanarak büyüteç loupes (2X-6X) diseksiyonu yararlı olabilir. hücrelerin düşük canlılığı prosedüründe ve ortam, tamponlar ve buz üzerinde sürekli kalan olmayan hücrelere gecikme ile ilgili olabilir.
Doku dis türüne özgü bu protokol sınırlamalarısected diğer anatomik engelleyici sitelerinin çalışılan (örn., Cilt veya mide-bağırsak) büyük dokular kullanılabilir olduğu karşılaştırıldığında, gingival dokular boyutudur.
/ - - Kendiliğinden periodontitis geliştirilen model Bununla birlikte, burada sunulan teknik bize LFA baskın hücre popülasyonlarının karakterize sağladı. LFA - / - fareler biz periodontitis 10 geliştirilmesi sırasında baskın bir IL-17 sitokin imza belirledi. Renkli akım sitometri analizi kullanarak, IL-17 11 hücresel kaynakları tanımlamak başardık. IL-17 ayar Bu hastalıkta lokal gingiva 10 içindeki TCRγδ T hücreleri, CD4 + T hücreleri ve doğal lenfoid hücreleri (LAK) tarafından hazırlanmıştır.
Bu metodoloji ve hatta küçük alt popülasyonlar tespit yeteneği ile izole hücrelerin önemli sayıda ile, artık kapsamlı bir anlama geliştirmek mümkün olacaktırdişeti bariyer bütünlüğünün korunması özel immün hücre ağının ing. Bu kritik anlayış bize dişeti ortamda bağışıklık yanıtlarını değerlendirmek için izin verecektir. Bu tekniği kullanılarak şimdi ek analizler ve karakterizasyonu yapılması gereken izin, akım sitometri hücre sıralama tarafından dişeti bağışıklık hücre ağının belirli bileşenleri izole etmek için devam edebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27 G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3 ml |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 ml FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
- Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
- Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. , (2015).
- Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
- Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
- Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).
