en cours d'analyse<em> In Vivo</em> Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons
Summary
Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.
Abstract
Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.
Introduction
Dans les organismes multicellulaires, la migration cellulaire est essentielle à la fois pour le développement de l'embryon où elle assure l'organisation des cellules dans les tissus et organes, et la vie adulte, où elle participe à l'homéostasie tissulaire (cicatrisation des plaies) et l'immunité. En plus de ces fonctions physiologiques, la migration des cellules est également impliqué dans diverses situations pathologiques, y compris, en particulier, les métastases du cancer.
La migration cellulaire a été analysée in vitro pendant des décennies, fournissant une compréhension globale des mécanismes moléculaires assurant les mouvements cellulaires sur des surfaces planes. In vivo cependant, les cellules sont confrontés à un environnement plus complexe. Il est apparu clairement au cours des dernières années que la migration au sein d'un organisme peut être influencé par des signaux externes tels que la matrice extracellulaire, des cellules ou des chimiokines sécrétées guidage migration voisine, et que les mécanismes d'entraînement la migration cellulaire peut varier de ce qui a été décrit <em> in vitro 1,2. Les mécanismes assurant la migration cellulaire in vivo ont reçu moins d' attention jusqu'à présent, principalement en raison de la difficulté technique accrue, par rapport à des études in vitro. In vivo analyse de la migration cellulaire , en particulier nécessite un accès optique directe aux cellules migrantes, techniques pour marquer les cellules uniques afin de voir leur dynamique et leur morphologie, ainsi que le gain ou la perte de fonction des approches pour tester le rôle des gènes candidats. Jusqu'à présent, seuls quelques systèmes modèles hébergeant ces caractéristiques ont été utilisées pour disséquer vivo la migration cellulaire 3.
Nous avons récemment utilisé la migration de la plaque préchordale prospective dans les embryons de poisson zèbre début comme un nouveau système de modèle pratique pour évaluer la fonction des gènes candidats dans le contrôle de la migration cellulaire in vivo 4,5 dans. Plaque préchordale prospective (également connu sous mesendoderm antérieur) est un groupe de cellules formant au début de Gastrulation sur la face dorsale de l'embryon. Au cours de la gastrulation ce groupe migre collectivement vers le pôle animal de l'embryon 6-8, pour former la plaque préchordale, un épaississement de mesendodermal, antérieure à la notochorde, et qui sous – tend la plaque neurale. La partie antérieure de la plaque préchordale donnera lieu à l' éclosion de la glande, tandis que sa partie postérieure contribue probablement à la tête mésoderme 9. Merci au développement externe et de la clarté optique de l'embryon de poisson, la migration cellulaire peut être directement et facilement observée dans cette structure.
La transplantation de cellules est une technique très puissante qui permet la création rapide et facile des embryons en mosaïque 10. Exprimer des marqueurs fluorescents cytosquelette dans les résultats des cellules transplantées dans l'étiquetage des cellules isolées, la morphologie et la dynamique qui peuvent être facilement observés. La combinaison de cette perte ou gain de fonction des approches permet l'analyse des fonctions des cellules autonomes d'une boîtegène didat.
Le protocole présenté décrit comment nous avons évalué la fonction de la composante sin1 de TORC2 dans le contrôle de la migration cellulaire et l' actine dynamique in vivo 5. Mais, comme mentionné dans les résultats et discuté plus loin, il pourrait être utilisé pour analyser l'implication potentielle d'un gène candidat pour contrôler la migration des cellules in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole présente un moyen facile d'étudier le rôle d'un gène candidat dans la migration cellulaire in vivo, en combinant la création d'embryons chimères en utilisant une transplantation de cellules avec l' imagerie en direct.
Création d'embryons mosaïques
Étude de la dynamique d'une cellule nécessite la visualisation de son contour pour analyser les extensions cytoplasmiques. Ceci peut être réalisé par marquage d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N° SFI20111203770 and N° PJA 20131200143.
Materials
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
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