analisando<em> In Vivo</em> Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish
Summary
Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.
Abstract
Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.
Introduction
Em organismos multicelulares, a migração celular é essencial tanto para o desenvolvimento do embrião em que assegura a organização de células em tecidos e órgãos, e para a vida adulta, em que participa a homeostase do tecido (cicatrização de ferimentos) e imunidade. Em adição a estas funções fisiológicas, a migração de células, também está envolvido em diversas situações patológicas, incluindo, em particular, a metástase do cancro.
A migração celular foi analisado in vitro ao longo de décadas, proporcionando uma compreensão global dos mecanismos moleculares que garantem movimentos celulares em superfícies planas. In vivo no entanto, as células são confrontados por um ambiente mais complexo. É claramente apareceu nos últimos anos que a migração dentro de um organismo pode ser influenciada por estímulos externos, tais como a matriz extracelular, as células ou quimioquinas segregadas orientadores migração vizinha, e que os mecanismos de condução migração de células pode variar do que foi descrito <em> in vitro 1,2. Os mecanismos que garantam na migração celular vivo têm recebido menos atenção até agora, principalmente por causa do aumento da dificuldade técnica, em comparação com estudos in vitro. In vivo análise da migração celular em particular requer acesso óptico direto para as células migram, técnicas para marcar células únicas em a fim de ver a sua dinâmica e morfologia, assim como o ganho ou a perda de função de abordagens para testar o papel dos genes candidatos. Até agora, apenas alguns sistemas modelo que albergam estas características têm sido utilizadas para dissecar na migração celular in vivo 3.
Recentemente, utilizou a migração da placa pré-cordal prospectivo em embriões de peixe-zebra iniciais como um novo sistema modelo conveniente para avaliar a função de genes candidatos para controlar a migração celular in vivo em 4,5. placa pré-cordal prospectivo (também conhecido como mesendoderm anterior) é um grupo de formação de células no início de Gastrulation no lado dorsal do embrião. Durante a gastrulação este grupo migra em conjunto em direcção ao polo animal do embrião 6-8, para formar a placa pré-cordal, um espessamento mesendodermal, anterior ao da notocorda e da placa neural subjacente. A parte anterior da placa precordial dará origem à glândula incubação, enquanto a sua parte posterior provavelmente contribui para a cabeça mesoderme 9. Graças ao desenvolvimento externo e clareza óptica do embrião de peixe, a migração de células pode ser facilmente e directamente observado nesta estrutura.
O transplante celular é uma técnica muito potente que permite a criação rápida e fácil de embriões de mosaico 10. Expressando marcadores fluorescentes do citoesqueleto em células transplantadas resultados na marcação de células isoladas, a morfologia e a dinâmica das quais pode ser facilmente observado. Combinando isso a perda ou ganho de função se aproxima permite a análise de funções das células-autônoma de uma latagene didata.
O protocolo apresentado descreve como avaliamos a função do componente SIN1 TORC2 no controle da migração celular e actina dinâmica in vivo 5. Mas, como mencionado nos resultados discutidos e ainda mais, que poderia ser utilizado para analisar a implicação potencial de qualquer gene candidato para controlar a migração celular in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo apresenta uma forma fácil para estudar o papel de um gene candidato na migração de células in vivo, através da combinação da criação de embriões quiméricos que utilizam o transplante de células com imagens ao vivo.
Criação de embriões mosaico
O estudo da dinâmica de uma célula requer a visualização do seu contorno para analisar extensões citoplasmáticas. Isto pode ser conseguido por marcação das células isoladas num…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N° SFI20111203770 and N° PJA 20131200143.
Materials
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
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