النخاعي عزل الخلايا من الجلد ماوس وتصريف العقدة الليمفاوية بعد الأدمة التحصين مع لايف الموهن<em> المتصورة</em> Sporozoites
Summary
We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Abstract
يبدأ عدوى الملاريا عندما يتم تلقيح المرحلة حيوان بوغي المتصورة في الجلد من مجموعة الثدييات عن طريق لدغة بعوضة. الطفيلي متحركة للغاية لا تصل إلا إلى الكبد لغزو خلايا الكبد وتتحول إلى شكل كرات الدم الحمراء المعدية. ومن يهاجر أيضا في الجلد والعقدة الليمفاوية القريبة استنزاف موقع الحقن، حيث يمكن الاعتراف بها والتي تدهورت بفعل المقيمين و / أو خلايا الدم النخاعي تجنيدهم. ذكرت التصوير حيوي داخلي تجنيد في وقت مبكر من فلوري الزاهية ليز-GFP الكريات البيض إيجابية في الجلد والتفاعلات بين sporozoites وCD11c و+ الخلايا في العقدة الليمفاوية استنزاف. نقدم هنا إجراء فعال لاسترداد، وتحديد وتعداد مجموعات فرعية خلية الدم النخاعي الذي يتم تجنيد للجلد الفأر واستنزاف العقدة الليمفاوية بعد الحقن داخل الأدمة للتحصين جرعة من sporozoites في نموذج الفئران. يوفر التوصيف المظهري باستخدام التدفق متعدد حدودي الخلويمقايسة موثوقة لتقييم أوائل التغيرات الخلوية الحيوية خلال الاستجابة الالتهابية للعدوى المتصورة.
Introduction
الملاريا هي واحدة من أعنف الأمراض المعدية في العالم، مما أسفر عن مقتل أكثر من نصف مليون شخص سنويا. العدوى عن طريق المتصورة، العامل المسبب للمرض، يبدأ من مرحلة ما قبل الكريات الحمر (PE). خلال هذه المرحلة، sporozoites حقنها في الجلد المضيف عن طريق البعوض أنوفيلي الإناث تصل إلى الكبد عن طريق الدم وتفرق خلايا الكبد الداخل في أشكال الطفيليات التي تصيب خلايا الدم الحمراء وتسبب أعراض المرض.
المراحل PE المتصورة تمثل هدفا مميزا لقاح لمكافحة الملاريا. في الواقع، ويعيش اللقاحات الموهنة ضد هذه المراحل، مثل الإشعاع الموهن sporozoites (RAS)، وقد أثبتت الطفيليات القبض وراثيا (GAP) أو الوقاية الكيميائية وsporozoites (CPS) قدرتها على حماية كل من القوارض والمضيفين البشري 1-9. في نموذج القوارض، وتجرى معظم الدراسات التطعيم باستخدام التطعيم عن طريق الحقن، الذي هو معيار الذهب من حيث الفعالية واقية. ومع ذلك، لم يتغير وصف مرحلة الجلد وأهمية العقدة الليمفاوية المرتبطة الجلد استنزاف (DLN) في انتزاع حماية تصورنا للمرحلة PE، وشدد على أهمية الطريق داخل الأدمة للحقن. التصوير حيوي داخلي من P. sporozoites berghei حقنها في الجلد من القوارض اظهر ان ~ 25٪ من اللقاح تصل إلى الكبد عن طريق الدم. ما تبقى من ~ 75٪ توزع بين DLN الداني (~ 15٪) والجلد (~ 50٪) 10،11، حيث نسبة صغيرة يمكن أن تتحول وتبقى على قيد الحياة لمدة أسابيع داخل خلايا الجلد 12،13. وعلاوة على ذلك، وصفت دراسات لاحقة أن إنشاء مناعة وقائية فعالة بعد التحصين داخل الأدمة يأخذ في المقام الأول في الجلد DLN، حيث يتم تنشيط الطفيل خلايا CD8 + T محددة، وبشكل هامشي فقط في الطحال أو الكبد dLNs 14،15.
في حينوركزت معظم الدراسات على تحديد خصائص الخلايا المستجيب المتورطين في إنشاء استجابة مناعية واقية، لا يعرف الكثير الكثير عن مصير الطفيليات الموهنة الحية حقنها في الجلد، خصوصا تفاعلاتها مع نظام المناعة الفطري. على وجه الخصوص، وتوصيف الخلايا العارضة للمستضد تشارك في الطفيلي مستضد امتصاص ومعالجة وعرض لخلايا CD8 + T هو من الأهمية بمكان، مع العلم أن يمكن أن يحدث PE اكتساب مستضد على حد سواء في الجلد ومقصورات DLN. ووصفت الدراسات السابقة التصوير حيوي داخلي تدفق المبكر للخلايا إيجابية فلوري الزاهية ليز-GFP في الجلد بعد عضة البعوض المعدية 16 في حين لوحظ التفاعل مبكرة بين sporozoites والخلايا الجذعية في DLN 10،17. وفي الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن أن sporozoites تلقيح في الجلد عن طريق البعوض يزيد من الحركة من كل من خلايا T الجذعية والتنظيمية في جلدالفئران، في حين لوحظ وجود انخفاض عدد خلايا مقدمة للمستضد في DLN 18.
نحن تهدف إلى تحديد وقياس أكثر دقة فرعية الكريات البيض جند في الجلد وDLN المقابلة وكذلك التفاعل مع الطفيل بعد الحقن داخل الأدمة للتحصين جرعة من RAS 19. في هذا السياق، ونحن عزل خلايا الدم النخاعي (CD45 + CD11b +) من كل الأنسجة وتتميز القطعان من الاهتمام من قبل عدة = تدفق حدودي الخلوي. وتمشيا مع الاستجابة المناعية هو موضح في مرحلة مبكرة من الليشمانيا كبير عدوى الجلد 20، واستجابة المضيف الأولية للحيوان بوغي حقن يتكون من التجنيد على التوالي من العدلات النوى (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C كثافة العمليات) تليها حيدات التهابات (CD45 + CD11b + Ly6G – Ly6C +) التي يتم تحديدها على أساس differentiآل التعبير عن علامات سطح Ly6G وLy6C.
نحن هنا وصف بروتوكول لعزل خلايا الدم النخاعي من الجلد الماوس وDLN بعد الحقن داخل الأدمة للتحصين جرعة من RAS المستخرج من الغدد اللعابية للبعوض المصابة. الحقن داخل الأدمة استنساخه ومعالجة الأنسجة هي الخطوات الحاسمة لتحديد التغيرات المظهرية بالتسلل السكان خلية داخل الأنسجة المصابة. النهج هو مفصل أدناه يوفر فحص موثوق لتقييم الجلد وDLN الاستجابة الالتهابية لالمتصورة الطفيليات ويمكن أن يمتد ليشمل النظم التجريبية المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في وجهة نظر تطعيم واسعة النطاق من البشر باستخدام لقاح الملاريا حيوان بوغي كله، واحدا من التحديات الرئيسية للتغلب هو تطوير طرق وأساليب الإدارة الطفيلي الأمثل لضمان التحصين الناجح وحماية 24،25. في البشر، وقد تم إجراء تقييم فعالية وقائية بوساطة الطفيليات الموهنة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر باتريشيا Baldacci، فانيسا Lagal وسابين Thiberge لقراءة نقدية، إيرينا Dobrescu وسابين Thiberge للمساعدة في التقاط الصور وبولين Formaglio للتعليم في مجال التصوير المجراة من الحركة حيوان بوغي في الجلد الماوس. كما نود أن نشكر ماريك Szatanik ومركز للإنتاج وإصابة بعوضة (CEPIA-معهد باستور) لتربية البعوض. وأيد هذه الدراسة من قبل الصندوق AXA البحوث والأموال من مختبر دي التميز "البيولوجيا التكاملية من الأمراض المعدية الناشئة" (منح رقم وكالة الاستخبارات الوطنية-10-LABX-62-IBEID).
Materials
| Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
| BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
| BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
| DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
| DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | – |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |
References
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
