Myeloïde Cell Isolatie van Mouse Skin en aftappen lymfkliertest Na Intradermal Immunisatie met levende verzwakte<em> Plasmodium</em> sporozoieten
Summary
We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Abstract
Malaria infectie begint wanneer de sporozoieten stadium van Plasmodium wordt geïnoculeerd in de huid van een zoogdiergastheer door een muggenbeet. De zeer beweeglijk parasiet niet alleen bereikt de lever hepatocyten binnen te vallen en te transformeren in erytrocyten-infectieuze vorm. Migreert ook in de huid en de proximale lymfeklieren afvoer de injectieplaats, waar het kan worden herkend en afgebroken door bewoner en / of gerekruteerde myeloïde cellen. Intravitale beeldvorming meldde de vroege werving van helder fluorescente Lys-GFP positieve leukocyten in de huid en de interacties tussen sporozoieten en CD11c + cellen in de drainerende lymfeklier. We presenteren hier een efficiënte procedure om te herstellen, te identificeren en op te sommen de myeloïde cel subsets die worden gerekruteerd om de muis huid en drainerende lymfeklier na intradermale injectie van immuniseren doses van sporozoieten in een muismodel. Fenotypische karakterisering met behulp van multi-parametrische stroom levert cytometrieeen betrouwbare test om vroege dynamische cellulaire veranderingen tijdens ontstekingsreactie Plasmodium infectie te beoordelen.
Introduction
Malaria is een van de dodelijkste besmettelijke ziekten in de wereld, het doden van meer dan een half miljoen mensen per jaar. Infectie door Plasmodium, de veroorzaker van de ziekte, begint met een pre-erytrocytaire (PE) fase. Tijdens deze fase sporozoieten geïnjecteerd in de gastheer huid door een vrouwelijke Anophelinen mug bereikt de lever via de bloedstroom en differentiëren in hepatocyten in de parasiet vormen die rode bloedcellen infecteren, waardoor de symptomen van de ziekte.
De PE van Plasmodium vormen een bevoorrechte doelwit voor anti-malaria vaccinatie. Sterker nog, levende verzwakte vaccins tegen deze fasen, zoals straling verzwakt sporozoieten (RAS), hebben genetisch gearresteerd parasieten (GAP) of chemoprofylaxe en sporozoieten (CPS) hun vermogen om zowel knaagdieren en menselijke gastheren 1-9 beschermen aangetoond. In het knaagdier model meeste vaccinatiestudies uitgevoerd met gebruikmaking intraveneuze immunisatie, De gouden standaard op het gebied van beschermende werkzaamheid. Echter, de beschrijving van een skin podium en het belang van de huid geassocieerd drainerende lymfeklier (DLN) in het uitlokken van de bescherming van onze perceptie van de PE-fase veranderd en benadrukte het belang van de intradermale route van injectie. Intravitale beeldvorming van P. berghei sporozoieten geïnjecteerd in de huid van knaagdieren heeft aangetoond dat slechts ~ 25% van het inoculum de lever via de bloedbaan bereikt. De resterende 75% ~ verdeelt tussen de proximale DLN (~ 15%) en de huid (~ 50%) 10,11, waarbij een klein deel kan transformeren en in leven blijven wekenlang in huidcellen 12,13. Bovendien latere studies beschreven dat de oprichting van effectieve beschermende immuniteit na intradermale immunisatie vindt vooral plaats in de huid-DLN, waar de parasiet specifieke CD8 + T-cellen worden geactiveerd, en slechts marginaal in de milt of lever-DLN 14,15.
Terwijlde meeste studies hebben zich geconcentreerd op de karakterisering van de effectorcellen betrokken bij de totstandkoming van beschermende immune respons, veel minder bekend over het lot van levende verzwakte parasieten geïnjecteerd in de huid, met name hun interactie met het aangeboren immuunsysteem. Vooral karakterisatie van antigeen presenterende cellen die deze parasiet antigen opname, verwerking en presentatie aan CD8 + T-cellen is van groot belang in de wetenschap dat PE antigen overname kan plaatsvinden zowel in de huid en dln compartimenten. Previous intravitale imaging studies beschreven een vroege toestroom van helder fluorescente Lys-GFP positieve cellen in de huid na een besmettelijke mugbeet 16 Terwijl eerder interacties tussen sporozoieten en dendritische cellen in de DLN 10,17 waargenomen. Meer recent is gerapporteerd dat sporozoieten geïnoculeerd in de huid door muggen verhoogt de motiliteit van zowel dendritische en regulatoire T cellen in de huid vanmuizen, terwijl het verlagen aantal antigeen presenterende cellen werd waargenomen in de DLN 18.
Ons doel identificatie en kwantificering nauwkeuriger de leukocyten subsets geworven in de huid en overeenkomstige DLN evenals die interactie met de parasiet na intradermale injectie van immuniserende dosis RAS 19. In deze context, die we myeloïde cellen (CD45 + CD11b +) Beide weefsels kenmerk subpopulaties plaats door multi = parametrische flowcytometrie. Consistent met de immuunrespons in de vroege fase van Leishmania major huidinfectie 20 beschreven, de primaire gastheer respons op injectie sporozoieten bestaat uit een opeenvolgende rekrutering van polymorfonucleaire neutrofielen (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) gevolgd door inflammatoire monocyten (CD45 + CD11b + Ly6G – Ly6C +), die zijn geïdentificeerd op basis van de verscal expressie van de Ly6G en Ly6C oppervlaktemerkers.
We beschrijven hier een protocol voor het isoleren van myeloïde cellen van de muis huid en DLN na intradermale injectie van immuniseren doses van RAS geëxtraheerd uit besmette mug speekselklieren. Reproduceerbare intradermale injecties en de verwerking van het weefsel zijn kritische stappen om fenotypische veranderingen van infiltrerende cel populatie binnen geïnfecteerde weefsels te kwantificeren. De aanpak hieronder verschaft een betrouwbare test om de huid en DLN ontstekingsreactie op Plasmodium parasiet beoordelen en kan worden uitgebreid tot verschillende experimentele systemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In het perspectief van grootschalige vaccinatie van mensen met een hele sporozoite malariavaccin, een van de belangrijkste uitdagingen te overwinnen is om routes en werkwijzen van toediening parasiet ontwikkelen om succesvolle immunisatie en bescherming 24,25 waarborgen. Bij mensen is de evaluatie van de beschermende werkzaamheid gemedieerd door levende verzwakte parasieten (LAP) uitgevoerd volgende natuurlijke muggenbeten 2, en intradermale, subcutane 25,26 en IV immunisaties 27.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Patricia Baldacci, Vanessa Lagal en Sabine Thiberge voor kritisch lezen, Irina Dobrescu en Sabine Thiberge voor hulp bij het maken van foto's en Pauline Formaglio voor het onderwijs in vivo beeldvorming van sporozoiet beweeglijkheid in de muis huid. We willen ook graag Marek Szatanik en het Centrum bedanken voor Productie en Infectie van Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) voor mosquito fokken. Deze studie werd ondersteund door de AXA Research Fund en de middelen van het Laboratoire d'Excellence "Integrative Biology of Emerging Infectious Diseases '(verlenen geen. ANR-10-LabX-62-IBEID).
Materials
| Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
| BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
| BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
| DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
| DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | – |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |
References
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
