Системная биология регулирования метаболическим путем эстрогеновых рецепторов Signaling при раке молочной железы
Summary
Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.
Abstract
С появлением -omics подходов наше понимание хронических заболеваний, как рак и метаболического синдрома улучшилось. Тем не менее, эффективная добыча информации, содержащейся в крупномасштабных наборов данных, которые получаются из экспрессии генов микрочипов, глубоких экспериментов секвенирования или метаболического профилирования имеет важное значение для раскрытия и затем эффективно нацелены на критические регуляторы больных фенотипов клеток. Эстрогеновых рецепторов α (ERα) является одним из факторов транскрипции, регулирующих мастер программы генов, которые являются важными для эстрогеном рака молочной железы. Для того, чтобы понять, в роли сигнализации ERα в грудном метаболизма рака мы использовали транскриптомных, cistromic и метаболомики данные из клеток MCF-7, обработанных эстрадиола. В этом докладе мы описали поколение образцов для РНК-Seq, Обломок-Seq и экспериментов метаболомики и интегративной вычислительного анализа полученных данных. Этот подход полезен в разграничении новый мольмеханизмы и сосудистых генов регуляторных контуров, которые регулируются с помощью определенного фактора транскрипции, который влияет на метаболизм нормальных или патологических клетках.
Introduction
Эстрогены являются важными регуляторами многих физиологических процессов в обеих женщин и мужчин в том числе репродуктивных тканей, нарушения обмена веществ, тканей головного мозга и костей 1. В дополнение к благотворное влияние в этих тканях, эстрогены также диск раковых заболеваний, которые возникают из молочной железы и репродуктивных тканей. Эстрогены в основном работают через ОЭ, чтобы вызвать специфические эффекты типа клеток. Глубокое секвенирование транскриптов регулируемых ERα использованием ERα ДНК анализа сайты связывания РНК-Seq и генома с использованием Обломок-Seq оказалось полезным, чтобы понять, как работает ERα в различных тканях и раковых заболеваний, которые возникают из них. Мы и другие опубликовали профили экспрессии генов , связанных с различными рецепторами (ERα против ERβ) 2,3, различных лигандов 3-5 и различных coregulators 2,4,6,7.
Секвенирование РНК является основным методом для изучения транскриптом, предлагая более высокую точность и эффективность по сравнению с микрочипов баАнализ экспрессии гена СЕПГ 8. РНК , полученной из клеточных линий 2-4,7, тканей или образцов опухолей упорядочиваются, сопоставляются с имеющимися геномных сборок и дифференциально регулируемых генов идентифицированы. Иммунопреципитации хроматина (ЧИП) используется для рассекают фактора транскрипции и coregulator хроматина связывания с известными сайтами связывания регуляторных. ЧИП-Seq (ЧИП следуют высокой пропускной последовательности) обеспечивает беспристрастную обнаружение глобальных сайтов связывания. Метаболомика является еще шире используется система биологии подход, который количественно измеряет, динамический многопараметрическая реакция живых систем на различные стимулы, включая химические вещества и генетических возмущений.
Выполнением глобального обмена веществ профилирование, функциональное считывание может быть получен из клеток, тканей и крови. Кроме того, информация из транскриптом экспериментов не всегда отражают реальные изменения в уровне ферментов, способствующих биохимических путей. комбинированныйанализ транскриптом и Метаболом данных позволяет идентифицировать и соотнести изменения в экспрессии генов с фактическими изменениями метаболита. Обуздывать информацию от всех этих крупномасштабных массивов данных обеспечивают механистические детали, чтобы понять роль транскрипционных факторов, регулирующих сложные биологические системы, особенно те, которые имеют отношение к развитию человека и таких заболеваний, как рак и диабет.
Сложный характер генома млекопитающих делает его сложно интегрировать и полностью интерпретировать данные, полученные из транскриптом, cistrome и Метаболом экспериментов. Определение функциональных связывания событий, которые приведут к изменениям в экспрессии генов-мишеней является важным, поскольку, как только функциональные сайты связывания идентифицированы; последующий анализ, в том числе транскрипции связывания (TF) анализа мотива, может быть выполнена с более высокой точностью. Это приводит к идентификации биологически значимых каскадами и механизмов TF. Также прямые comparisна РНК-Seq и ЧИП-Seq экспериментов не всегда возможно, так как данные из каждого эксперимента имеют различные масштабы и шумы, а в некоторых случаях значимые сигналы замутнено шумом населения. Мы не знаем каких-либо исследований, которые интегрированы информацию из этих трех независимых, но взаимосвязанных подходов, чтобы понять прямой регуляции метаболизма путем ERα при раке молочной железы. Таким образом, наша общая цель в этой статье, чтобы связать продуктивные связывания событий в экспрессии генов и изменения метаболита. Для достижения этой цели, мы интегрировали данные из РНК-Seq, чиповых ПОСЛ и метаболомики экспериментов и выявили те эстроген индуцированной ERα связывания событий, которые приведут к изменениям экспрессии генов в метаболических путях. Впервые, мы предоставляем полный набор протоколов (Рисунок 1) для генерации Обломок-Seq, РНК-Seq и метаболомика профилирование и проведение интегративный анализ данных для выявления новых схем генов , регулирующих метаболизм молочной железылиний раковых клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы описали поколение и интегративный анализ РНК-Seq, Обломок-Seq и данных метаболомики из клеток MCF-7, которые лечат с Е2. Мы разработали набор протоколов разработки стратегии использовать наиболее эффективные методы и удобный для пользователя мягкие изделия, которые произво?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Национального института продовольствия и сельского хозяйства, Министерства сельского хозяйства США, награду Illu-698-909 (ZME) и Pfizer, Inc (ZME). Его содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Министерства сельского хозяйства США.
Materials
| Triglyceride Mix | Sigma | 17810-1AMP-S | |
| Oleic acid | Sigma | O1257-10MG | Oleic Acid-Water Soluble powder |
| TRIzol Reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| Dynabeads Protein A | Life technologies | 10006D | |
| Dynabeads Protein G | Life technologies | 10007D | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | DNA isolation of input sample |
| ZYMO ChIP-DNA Isolation kit | Zymo Research | D5205 | ChIP DNA Clean & Concentrator |
| Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Quantitation |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | RNA purification |
| DEPC Treated Water | LIFE TECH | 462224 | Dnase/Rnase Free |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | With 1/8 probe |
| Fisher Scientific Sound Enclosure | Fisher Scientific | FB-432-A | For sound reduction |
| Eppendorf Tubes 5.0mL | Eppendorf | 0030 119.401 | 200 tubes (2 bags of 100 ea.) |
| Random Primer Mix | NEB | S1330S | |
| DNTP MIX | NEB | N0447S | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | NEB | M0253S | |
| FastStart SYBR Green Master | ROCHE | 4673484001 | |
| Agarose | Fisher | BP160100 | 1.5% agarose gel |
| Qubit® RNA HS Assay Kit | Life technologies | Q32852 | RNA quantification (100 assays) |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 4693116001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| Qubit® Assay Kits | Life technologies | Q32850 | For 100 assays |
| Automated cell counter | ORFLO | MXZ000 | |
| tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
| Victor X5 Multilple plate reader | PerkinElmer | 2030-0050 | |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | |
| Magnetic Stand | Diagenode | B04000001 | |
| Fast Real-time PCR system | Applied Science | 4351405 |
References
- Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
- Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).
- Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).
- Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).
- Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
- Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
- Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Invitrogen. . Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- . . Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , (2006).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
- Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
- Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).
