Meme Kanserinde Östrojen Reseptör Sinyali tarafından Metabolik Yönetmelik Sistem Biyolojisi
Summary
Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.
Abstract
-omics gelişine kanser ve metabolik sendrom gibi kronik hastalıkların anlayışımız geliştirdi yaklaşır. Ancak, gen ifade mikroarrayler, derin sıralama deneyleri veya metabolik profil elde edilen büyük ölçekli veri kümelerinde bilginin etkin madencilik ortaya çıkarmak önemlidir ve daha sonra etkili bir şekilde hastalıklı hücre fenotipleri kritik düzenleyiciler hedef. Östrojen Reseptör α (ÖRa) östrojen duyarlı meme kanseri için önemli olan gen programları düzenleyen ana transkripsiyon faktörlerinin biri. ÖRa meme kanseri metabolizmasında sinyalleme rolünü anlamak için, biz estradiol ile tedavi edilmiş MCF-7 hücrelerinden, transkriptomik cistromic ve metabolomic verilerini kullanarak. Bu yazıda RNA Sek, ChIP-Sek ve metabolomikler deneyleri ve elde edilen verilerin bütünleştirici hesaplama analizi için numune nesil nitelendirdi. Bu yaklaşım, yeni köstebek ortaya koymaya yararlıdırnormal veya hastalıklı hücrelerin etkileri metabolizması, belirli bir transkripsiyon faktörü ile düzenlenmiştir vasküler mekanizmaları ve gen düzenleyici devre.
Introduction
Östrojenler, üreme organı dokularında metabolik dokular, beyin ve kemik 1 de dahil olmak üzere, her iki kadın ve erkeklerde çok sayıda fizyolojik süreçte önemli regülatörleridir. bu dokularda yararlı etkilerine ek olarak, östrojenler meme ve yeniden üretici dokulara ortaya çıkan kanserlerin sürücü. Östrojenler esas hücre tipi özel etkilere neden Erler ile çalışmak. ChIP-Seq kullanarak RNA Seq ve genom ÖRa DNA bağlayıcı siteleri analizi kullanılarak ÖRa tarafından düzenlenen transkript derin sıralama ÖRa bunlardan kaynaklanan farklı dokularda ve kanserlerde nasıl çalıştığını anlamak için yararlı olduğunu kanıtladı. Biz ve diğerleri gen ifadesi (ÖRP vs ÖRa) farklı reseptörler ile ilişkili profilleri 2,3, farklı ligandlar 3-5 ve farklı koregülatörleri 2,4,6,7 yayınladı.
RNA Seq mikroarray ba göre daha yüksek hassasiyet ve verimlilik sunan transcriptome incelemek için ana yöntemsed gen ekspresyon analizi 8. Hücre hatları 2-4,7, doku veya tümör örneklerinden elde edilen RNA mevcut genomik meclisleri eşleştirilir, dizilir ve ayrı düzenlenmiş genler tanımlanmıştır. Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) bilinen düzenleme bağlanma sitelerinin bağlanma transkripsiyon faktörü ve coregulator kromatin incelemek için kullanılır. ChIP-Seq (yüksek verimlilik sıralaması takip ChIP) Küresel bağlama siteleri tarafsız algılanmasını sağlar. Metabolomik başka giderek kullanılan sistem biyolojisi yaklaşımı, nicel önlemler, kimyasallar ve genetik perturbations dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara canlı sistemlerin dinamik multiparametrik yanıttır.
Genel metabolik profil gerçekleştirilerek etkin bir okuma hücre, doku, kan elde edilebilir. Buna ek olarak, transcriptome deneyler bilgi her zaman biyokimyasal yollar katkı enzim seviyesinde gerçek değişiklikleri yansıtmıyor. kombinetranskriptom ve metabolome verilerinin analizi, tespit ve gerçek metabolit değişikliklerle gen ifadesinde bir değişiklik ilişkili olanak sağlamaktadır. Bu büyük ölçekli veri setleri mekanistik ayrıntıları tüm bilgileri Harnessing kompleks biyolojik sistemler, insan gelişimi ve kanser ve diyabet gibi hastalıklara ilgilendirmeyen özellikle olanları düzenleyen transkripsiyon faktörlerinin rolünü anlamak için.
memeli genomunun karmaşık doğası zorlu entegre ve tam transcriptome, cistrome ve metabolome deneylerden elde edilen verileri yorumlamak için yapar. bir zamanlar işlevsel bağlanma siteleri tanımlanır çünkü hedef genlerin ifadesi önemlidir değişikliklere yol açacak fonksiyonel bağlayıcı olayları belirlenmesi; transkripsiyon bağlanma (TF) motif analizi de dahil olmak üzere, analiz takip eden, yüksek hassasiyetle gerçekleştirilebilir. Bu biyolojik olarak anlamlı TF basamak ve mekanizmaların tanımlanmasına yol açar. Ayrıca doğrudan comparisHer bir deneyden alınan veriler terazi ve sesler farklı ve bazı durumlarda anlamlı sinyalleri popülasyon gürültü ile gizlenmiş olan RNA-Seq ve yonga-Seq deneylerin her zaman mümkün değildir. Biz meme kanseri ÖRa doğrudan metabolik düzenleme anlamak için bu üç bağımsız ancak ilgili yaklaşımlardan bilgi entegre herhangi çalışmanın farkında değildir. Bu nedenle, bu yazıda bizim genel amacı gen ifadesi ve metabolit değişikliklere üretken bağlayıcı olayları ilişkilendirmek olduğunu. Bu hedefe ulaşmak için, biz RNA Sek, ChIP-Seq ve metabolomikler deneylerden elde edilen verilerin entegre ve metabolik yollar gen ifadesi değişikliklere yol açacak olayları bağlama ÖRa kaynaklı olanlar östrojen belirledi. İlk kez, biz meme metabolizmasını düzenleyen yeni gen devreleri ortaya çıkarmak için ChIP-Seq, RNA Seq ve metabolomik profil üreten ve veri bütünleştirici analizini gerçekleştirmek için protokoller (Şekil 1) komple bir set sağlamakkanser hücre çizgileri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, E2 ile tedavi edilir MCF-7 hücrelerinden üretimini ve RNA-Sek, ChIP-Sek ve metabolomikler verilerinin bütünleştirici analizini nitelendirdi. Biz biyolojik ilgili keşif üretmek en etkin yöntem ve kullanıcı dostu yumuşak mallar kullanmak için strateji protokoller bir dizi geliştirdi. Bildiğimiz kadarıyla, bizim üç farklı analiz ve ÖRa doğrudan meme kanseri hücrelerinde düzenlenmiş belirlenen yeni metabolik yollar dan -omics verileri entegre etmek ilk çalışmadır.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, ABD Tarım Bakanlığı, ödül Illu-698-909 (ZME) ve Pfizer, Inc (ZME) hibe tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka ABD Tarım Bakanlığı resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Triglyceride Mix | Sigma | 17810-1AMP-S | |
| Oleic acid | Sigma | O1257-10MG | Oleic Acid-Water Soluble powder |
| TRIzol Reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| Dynabeads Protein A | Life technologies | 10006D | |
| Dynabeads Protein G | Life technologies | 10007D | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | DNA isolation of input sample |
| ZYMO ChIP-DNA Isolation kit | Zymo Research | D5205 | ChIP DNA Clean & Concentrator |
| Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P7589 | DNA Quantitation |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | RNA purification |
| DEPC Treated Water | LIFE TECH | 462224 | Dnase/Rnase Free |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | With 1/8 probe |
| Fisher Scientific Sound Enclosure | Fisher Scientific | FB-432-A | For sound reduction |
| Eppendorf Tubes 5.0mL | Eppendorf | 0030 119.401 | 200 tubes (2 bags of 100 ea.) |
| Random Primer Mix | NEB | S1330S | |
| DNTP MIX | NEB | N0447S | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | NEB | M0253S | |
| FastStart SYBR Green Master | ROCHE | 4673484001 | |
| Agarose | Fisher | BP160100 | 1.5% agarose gel |
| Qubit® RNA HS Assay Kit | Life technologies | Q32852 | RNA quantification (100 assays) |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 4693116001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Each tablet is sufficient for 10ml lysis buffer |
| Qubit® Assay Kits | Life technologies | Q32850 | For 100 assays |
| Automated cell counter | ORFLO | MXZ000 | |
| tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
| Victor X5 Multilple plate reader | PerkinElmer | 2030-0050 | |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | |
| Magnetic Stand | Diagenode | B04000001 | |
| Fast Real-time PCR system | Applied Science | 4351405 |
References
- Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
- Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).
- Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).
- Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).
- Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
- Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
- Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Invitrogen. . Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- . . Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , (2006).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
- Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
- Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).
