In Vivo Alkaline Comet Assay et Enzyme modifiée Alkaline Comet Assay pour mesurer Breaks brin d' ADN et l' ADN oxydative dommages de foie de rat
Summary
The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.
Abstract
Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.
Introduction
Le test des comètes alcalines mesure les ruptures d'ADN au niveau d'une seule cellule. Les suspensions de cellules individuelles sont noyées dans agarose sur une lame de microscope et les cellules ont été lysées pour former nucléoïdes, qui contiennent des boucles surenroulées de l'ADN. Electrophorèse à pH> 13 résultats dans la perte de surenroulement dans des boucles d'ADN contenant la rupture des brins, les brins d'ADN libérés migrent vers l'anode, la création de structures de comète qui peuvent être observées par microscopie à fluorescence. ADN Fragmenté migre de la «tête» de la comète dans la «queue» en fonction de la taille du fragment, et la fluorescence relative de la queue de la comète par rapport à l'intensité totale (de la tête et de la queue) peut être utilisé pour quantifier l' ADN rupture 1 , 2. Le test est simple, sensible, polyvalent, rapide et relativement peu coûteux 1. La détection d'ADN fragmenté causées par des agents endommageant l'ADN est utilisé un dosage pour la quantification des lésions de l'ADN dans les cellules ou les noyaux isolés à partir individeux tissus d'animaux traités avec le matériau (x) potentiellement génotoxiques. En raison de ses avantages, le test in vivo de la comète est recommandé comme un second test in vivo de génotoxicité (jumelé avec le test du micronoyau in vivo) pour effectuer des évaluations de sécurité des produits en cours Conférence internationale sur l' harmonisation (ICH) 3 et Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA ) 4 lignes directrices réglementaires. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé le test pour évaluer des dommages de l' ADN in vivo induite par les ingrédients alimentaires, les produits pharmaceutiques et les nanomatériaux 5-10. Rat foie sera utilisé comme exemple dans ce protocole, mais le test des comètes peut être réalisée avec d'autres tissus / organes d'animaux de laboratoire, aussi longtemps que des cellules individuelles intactes peuvent être isolées à partir du tissu.
Certains types de dommages à l'ADN sont difficiles à détecter que les ruptures d'ADN sans modifier le test des comètes alcalines de base. Dans le cas des dommages oxydatifs à l'ADN, brin breaks peuvent être créés au niveau des lésions oxydatives de l'ADN par digestion avec des enzymes de réparation tels que la 8-oxoguanine ADN-N glycosylase humaine 1 (hOGG1, ce qui crée des pauses à la 8-oxoguanine (8 oxoGua) et la méthyl-fapy-guanine 11. en outre, l' endonucléase III (endo III) crée des sauts principalement à pyrimidines oxydées 1. Ainsi, l'addition d'une étape enzymatique digestion permet le dosage d' une méthode spécifique et sensible pour mesurer les dégâts oxydatifs de l' ADN in vivo 12. en utilisant ces tests, nous avons démontré les dommages oxydatifs à l'ADN induite par la substance toxique dans le foie des rats et des souris 6-8 et dans le cœur des rats 10.
Le test des comètes alcalines a de nombreuses applications en toxicologie génétique et la biosurveillance humaine: 1) en tant que suivi dans l' essai in vivo pour génotoxiques identifiés par sensibles tests in vitro 3,13, 2) pour évaluer les mécanismes de lésions de l' ADN xénobiotiques-induite dans plusieurs tissus 14, 3) pour examiner si unecancérogène fonctionne à l' aide d' un génotoxique ou un mode non génotoxique d'action (MOA) 7, 4) pour évaluer l' ADN réparation des dommages 15, 5) pour étudier les maladies humaines et les expositions professionnelles 16 et 6) comme un test de criblage à haut débit potentiel de spécifique d' un organe de génotoxicité 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit la mesure concurrente de dommages à l'ADN et à l'oxydation directe dans le foie de rat au niveau de la cellule unique. Le protocole général est applicable à tout tissu à partir duquel les cellules ou les noyaux individuels peuvent être isolés avec un minimum de lésions de l' ADN induites par le traitement ( à savoir, des lésions de l' ADN induites et non par l'agent d'essai, mais la manipulation et le traitement des tissus d'origine animale). Dans notr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the US Food and Drug Administration. We acknowledge the original publication of the CPA study by Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutation Research 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)
Materials
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca++, Mg++ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels, (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1000 |
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