In Vivo Alkaline Comet analys och enzymmodifierat Alkaline Comet analys för att mäta DNA-strängbrott och oxidativ DNA-skador i råttlever
Summary
The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.
Abstract
Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.
Introduction
Det alkaliska komet Analysen mäter DNA-strängbrott vid enkelcellnivån. Suspensioner av enskilda celler är inbäddade i agaros på ett objektglas och cellerna lyserades för att bilda nucleoids, vilka innehåller supertvinnade slingor av DNA. Elektrofores vid pH> 13 resulterar i förlusten av supercoiling i DNA slingor innehåller strängbrott, med frigjorda DNA-strängarna migrerar mot anoden, skapar kometliknande strukturer som kan observeras genom fluorescensmikroskopi. Fragmenterat DNA vandrar från "huvudet" av komet i "svans" baserat på storleken av fragmentet, och den relativa fluorescensen hos kometsvans jämfört med den totala intensiteten (huvud och svans) kan användas för att kvantifiera DNA-brott 1 , 2. Analysen är enkel, känslig, mångsidig, snabb, och relativt billiga 1. Detektion av fragmenterat DNA orsakad av DNA-skadande medel används en analys för kvantifiering av DNA-skada i celler eller isolerade kärnor från indidubbla vävnader hos djur som behandlats med potentiellt genotoxisk material (s). På grund av dess fördelar, är kometen analysen in vivo rekommenderas som en andra in vivo genotoxiska analys (parad med mikrokärntest in vivo) för att leda produktriskvärderingar i nuvarande International Conference on Harmonisation (ICH) 3 och Europeiska myndigheten för livsmedelssäkerhet (EFSA ) 4 föreskrifter. I vårt labb har vi använt analysen för att utvärdera in vivo DNA-skada inducerad av livsmedelsingredienser, läkemedel och nanomaterial 5-10. Råttlever kommer att användas som ett exempel i detta protokoll, men komet analys kan utföras med andra vävnader / organ hos försöksdjur, så länge som intakta enskilda celler kan isoleras från vävnaden.
Vissa typer av DNA-skador är svåra att upptäcka som DNA-strängbrott utan att modifiera den grundläggande alkaliska kometanalys. I fallet med oxidativ DNA-skada, del Bsidbrytningar kan skapas på oxidativa skador i DNA genom digerering med reparationsenzymer såsom humant 8-oxoguanine-DNA-N-glykosylas 1 (hOGG1, vilket skapar avbrott i 8-oxoguanine (8-oxoGua) och metyl-fapy-guanin 11. också, Endonukleas III (Endo III) skapar raster huvudsakligen vid oxiderade pyrimidiner 1. tillsatsen av ett enzym-digereringssteget gör analysen en specifik och känslig metod för mätning av oxidativ DNA-skada in vivo 12. med hjälp av dessa analyser har vi visat toxikant-inducerad oxidativ DNA-skada i levern hos råttor och möss 6-8 och i hjärtat hos råttor 10.
Den alkaliska komet analysen har många tillämpningar inom genetisk toxikologi och biologisk övervakning: 1) som en uppföljning in vivo-analys för genotoxins identifierats av känsliga in vitro tester 3,13, 2) att utvärdera mekanismerna för xenobiotiska-inducerad DNA-skador i flera vävnader 14, 3) att undersöka om encancerframkallande fungerar med hjälp av en genotoxisk eller en icke-genotoxiska verkningssätt (MOA) 7, 4) för att utvärdera DNA-skador reparation 15, 5) för att undersöka mänskliga sjukdomar och yrkesmässig exponering 16, och 6) som en potentiell high-throughput screening test för organspecifika genotoxicitet 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver den samtidiga mätningen av både direkt och oxidativ DNA-skada i råttlever vid den enda cellnivå. Det allmänna protokollet är tillämpbar på varje vävnad från vilken enstaka celler eller kärnor kan isoleras med minimal bearbetning-inducerad DNA-skada (dvs DNA-skada inducerad inte genom testmedlet, utan genom hantering och bearbetning av de djurvävnader). I vår forskning har vi genomfört alkaliska komet analyser på celler från benmärg 7,9, mage 6, nj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the US Food and Drug Administration. We acknowledge the original publication of the CPA study by Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutation Research 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)
Materials
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca++, Mg++ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels, (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1000 |
References
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the ‘comet’ assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
- Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
- Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
- Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
- Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
- Smith, C. C., O’Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
- Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
- Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
- Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013)
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
- Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , (2000).
- Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
- Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).
