En simpel Bioassay for Vurdering af Vascular endotelvækstfaktorer
Summary
Vi beskriver en simpel cellebaseret bioassay til påvisning, kvantificering og overvågning af aktiviteten af medlemmer af den vaskulære endotelvækstfaktor familien af ligander. Assayet anvender kimære receptorer udtrykt i en faktor-afhængig cellelinie at tilvejebringe en semi-kvantitativ eller kvantitativ vurdering af receptorbinding og tværbinding af liganden.
Abstract
Analysen af receptortyrosinkinaser og deres vekselvirkende ligander involveret i vaskulær biologi er ofte en udfordring på grund af den konstitutive ekspression af familier af beslægtede receptorer, en bred vifte af beslægtede ligander og vanskeligheden ved at behandle primære kulturer af specialiserede endotelceller. Her beskriver vi en bioassay til påvisning af ligander til det vaskulære endotel vækstfaktorreceptor-2 (VEGFR-2), et centralt transducer af signaler, der fremmer angiogenese og lymfangiogenese. Et cDNA, der koder en fusion af det ekstracellulære (ligandbindende) region VEGFR-2 med de transmembrane og cytoplasmiske regioner af erythropoietin-receptoren (EPOR) udtrykkes i faktor-afhængige cellelinie Ba / F3. Denne cellelinie vokser i nærvær af interleukin-3 (IL-3) og tilbagetrækning af denne faktor resulterer i celledød inden 24 timer. Ekspression af VEGFR-2 / EPOR receptor fusion giver en alternativ mekanisme til at fremme overlevelse og potentially proliferation af stabilt transficerede Ba / F3-celler i nærvær af en ligand, som kan binde og tværbinding den ekstracellulære del af fusionsproteinet (dvs. en, der kan tværbinde VEGFR-2 ekstracellulære region). Assayet kan udføres på to måder: en semi-kvantitativ tilgang, hvor små volumener af ligand og cellerne tillader et hurtigt resultat i 24 timer, og en kvantitativ fremgangsmåde involverer surrogatmarkører for en levedygtige celler. Assayet er relativt let at udføre, er yderst reagerer på kendte VEGFR-2-ligander og kan rumme ekstracellulære inhibitorer af VEGFR-2 signalering såsom monoklonale antistoffer mod receptoren eller ligander, og opløselige ligand fælder.
Introduction
Det vaskulære endotel vækstfaktor (VEGF) familie af udskilte protein vækstfaktorer og deres beslægtede celleoverfladereceptorer er en vigtig og forskelligartet gruppe af opløselige ligander og membran-embedded receptorer, henholdsvis den funktion på transduktion signaler over cellulære membraner. De fungerer hovedsagelig i endotelceller, men også i celler af epitelial oprindelse og dem af immunsystemet 1,2. Signalveje engageret af ligand-aktiverede VEGF-receptorer (VEGFRs) er kritiske i større patologier, såsom aldersrelateret maculadegeneration og cancer, og terapeutiske målretning dem er i hyppig klinisk anvendelse (f.eks det monoklonale antistof bevacizumab som retter sig mod VEGF-A) 3,4.
En af kompleksiteten i VEGF familien er mangfoldigheden af opløselige ligander til stede i naturen (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF proteiner kodet af parapox virus familien orf og slangegift VEGF, plus andre hæmmendeisoformer af VEGF-A) 2.
Disse ligander interagerer med tre medlemmer af receptortyrosinkinase-familien, nemlig VEGFR-1, VEGFR-2 og VEGFR-3. Disse receptorer er variabelt udtrykkes på forskellige celletyper, men er ofte co-udtrykkes på overfladen af endotelceller, der beklæder blod- og lymfekar i alle størrelser 5. VEGFR-2 kan binde pattedyr ligander VEGF-A 6, VEGF-C 7 og VEGF-D 8,9 samt orf virus VEGF 10 og slangegift VEGF 11. VEGFR-2 spiller en vigtig rolle som drivkraft angiogenese (vækst af nye blodkar fra allerede eksisterende fartøjer) af fosterudviklingen, sårheling, cancer og øjensygdomme. I disse sammenhænge, ligander, såsom VEGF-A, -C og -D binder og aktiverer receptoren på blod vaskulære endotelceller 12-15. På lymfatiske endotelceller, VEGFR-2 spiller en rolle i lymfangiogenese, dannelsen af nye lymfekar 16. VEGFR-2 kan også fremme dilatation og udvidelse af store arterier og lymfekarrene i raske væv og sygdomme 17. En fuldstændig forståelse af VEGFR-2: ligand interaktioner er derfor vigtigt for udviklingen af inhibitorer til anvendelse ved behandling angiogeneseafhængige sygdomme 18. Mens de fleste isoformer af VEGF-A binder til VEGFR-2 er proteolytisk spaltning af VEGF-C og VEGF-D kræves for at frigive et fragment bestående af VEGF-homologi domæne, der udviser høj affinitetsbinding til VEGFR-2 19,20.
Vi har udviklet en bioassay til overvågning ligander af VEGFR-2, der er designet til at omgå behovet for primære endotelceller, som er teknisk vanskeligt at passage, dyrt at købe og kultur (kræver specialiseret medium) 21 og udtrykke flere VEGFRs og tilhørende samarbejde receptorer 22. Heterodimerisering af VEGFR-2 med andre VEGF-receptorer eller co-receptorer kan forårsage uønsket kompleksitet, når der sigtes til study binære receptor-ligand-interaktioner, evaluering aktivitet henføres til en specifik receptor, eller vurdering af effekten af inhiberende reagenser. 23. Bioassayet bevarer mobilitet den relevante receptor i cellemembranen og tillader evaluering af en ligand evne til at binde og tværbinde VEGFR-2 ekstracellulære region.
Bioassayet er afhængig af skabelsen af en kimerisk receptor, hvor den ekstracellulære region af en VEGF-receptor (i dette tilfælde VEGFR-2) er fusioneret til det transmembrane og intracellulære regioner af erythropoietin-receptoren (EPOR), et medlem af cytokinreceptorfamilien 8,24. Dette fusionsprotein udtrykkes derefter i faktor-afhængige pro-B-cellelinje Ba / F3, hvorpå stimulering med en ligand, som kan binde og tværbinding det ekstracellulære domæne af receptoren forårsager aktivering af den cytoplasmiske effektor region, som er i stand af transducere en overlevelse signal via Janus kinaser (Jaks) for at fremme celleoverlevelse og / eller proliferation. I modsætning hertil ekspression af fuldlængde VEGFR-2 i samme celletype, og stimulering med liganden, ikke fremmer celleoverlevelse og proliferation, hvilket viser, at de proximale signalering effektorer af VEGFR-2 reaktionsvejen er ikke tilgængelige i denne celletype.
Vi har brugt assayet i forskellige sammenhænge til at udforske binding af hidtil ukendte VEGFR-2 ligander 10,19,20,24-29. I kombination med en VEGFR-3-EPOR-Ba / F3-assay, har vi sammenlignet de relative aktiviteter af VEGF-C og VEGF-D vækstfaktorer for binding og tværbinding VEGFR-2 og VEGFR-3 30. Assayet er blevet anvendt til at karakterisere den inhiberende aktivitet af neutraliserende monoklonale antistoffer til VEGFR-2 eller VEGF-D, opløselig VEGFR-2 fælde og peptidefterligninger rettet mod VEGF-familien 31. Assayet blev også anvendt til at vise evnen hos VEGF'erne fra forskellige orf virusstammer til at binde og tværbinde VEGFR-2 før afprøvning i primære endotelceller <sop> 10,26. Assayet er særligt anvendelig til hurtig screening af mutanter af VEGF'erne som hurtigt kan vurderes for aktivitet før de føres til de mere arbejdskrævende endotel celleassays 25 eller ved vurderingen protokoller for oprensning af vækstfaktorer 27.
Assayet beskriver vi er let at udføre, og den semikvantitative versionen giver mulighed for hurtig bestemmelser, der undertiden nødvendige, når overvågning af produktionen eller oprensning af vækstfaktorer, antistoffer eller opløselige receptor-domæner for andre eksperimenter. Brugervenligheden af analysen gør det til et ideelt supplement til yderligere og mere komplette studier udført med primære endotelceller på basis af blod eller lymfekar fra bestemte væv eller organsystemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den her beskrevne assay er afhængig af at bruge celler af høj levedygtighed, som er afhængige af vækstfaktorer. Celler skal derfor være omhyggeligt dyrket for at sikre, at de er faktor-afhængige, og fastholde udtryk for kimære receptor. Sikring af, at mediet er frisk gjort og ikke opbevares i alt for lang periode, og at WEHI-3D CM er meget aktiv er vigtig. Celler skal vaskes grundigt fra IL-3-holdigt medium i assaymediet at sikre, at ingen residual IL-3 forurener testen, når udsættelse af cellerne for red…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.
Materials
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | N/A | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | N/A | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
References
- Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
- Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
- Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
- Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
- Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
- Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
- Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
- Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
- Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
- Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
- Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
- Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
- Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
- Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
- Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
- Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
- Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
- Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
- Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
- McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
- Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
- Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
- Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
- Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
- Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
- Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
- Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
- Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
- Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
- Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
- Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
- Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).
