En enkel Bioassay for Evaluering av vaskulær endotelial vekstfaktorer
Summary
Vi beskriver en enkel cellebasert bioanalyse for å påvise, kvantifisere og overvåking av aktiviteten av medlemmer av vaskulær endotelial vekstfaktor familie av ligander. Analysen anvender kimære reseptorer uttrykt i en faktoravhengig cellelinje for å gi en semi-kvantitativ eller kvantitativ vurdering av reseptor-binding og tverrbinding av liganden.
Abstract
Analysen av reseptor-tyrosin-kinaser og deres samvirkende ligander involvert i vaskulære biologi er ofte vanskelig på grunn av den konstitutive ekspresjon av familier av beslektede reseptorer, et bredt spekter av beslektede ligander og vanskeligheten med å håndtere primære kulturer av spesialiserte endotelceller. Her beskriver vi et bioassay for påvisning av ligander til vaskulær endotel vekstfaktor-reseptor-2 (VEGFR-2), en nøkkel transduser av signaler som fremmer angiogenese og lymphangiogenesis. Et cDNA som koder for en fusjon av det ekstracellulære (ligand-binding) region av VEGFR-2 med de transmembrane og cytoplasmatiske regioner av erytropoietinreseptoren (Epor) er uttrykt i faktor-avhengige cellelinje Ba / F3. Denne cellelinje vokser i nærvær av interleukin-3 (IL-3) og tilbaketrekking av denne faktoren resulterer i død av celler i løpet av 24 timer. Uttrykk av VEGFR-2 / Epor reseptoren fusjon gir en alternativ mekanisme for å fremme overlevelse og Potentiaslly spredning av stabilt transfekterte Ba / F3-celler i nærvær av en ligand som er i stand til binding og tverrbinding av den ekstracellulære del av fusjonsproteinet (dvs., en som kan kryssbinde VEGFR-2 ekstracellulære region). Analysen kan utføres på to måter: en semi-kvantitativ metode hvori små volumer av ligand og celler som tillater en hurtig resultat i 24 hr, og en kvantitativ tilnærming involverer surrogatmarkører for et levedyktig celleantall. Analysen er forholdsvis lett å utføre, er meget mottakelig for kjente VEGFR-2-ligander og rommer ekstracellulære inhibitorer av VEGFR-2-signalering, for eksempel monoklonale antistoffer mot reseptoren eller ligander, og løselige ligand feller.
Introduction
Den vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) familie av utskilte proteiner vekstfaktorer og deres beslektede celleoverflatereseptorer er en viktig og mangfoldig gruppe av løselige ligander og membranreseptorer innebygd, henholdsvis som funksjon på overførende signaler på tvers av cellemembraner. De fungerer hovedsakelig i endotelceller, men også på celler av epitelial opprinnelse og de av immunsystemet 1,2. Signalveier som er engasjert av ligand-aktiverte VEGF reseptorer (VEGFRs) er kritisk i store patologi, som aldersrelatert makuladegenerasjon og kreft, og therapeutics rettet mot dem er i hyppig klinisk bruk (f.eks monoklonalt antistoff bevacizumab som er rettet mot VEGF-A) 3,4.
En av kompleksiteten av VEGF familien er mangfoldet av løselige ligander tilstede i naturen (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF proteiner kodet av parapox virus familien orf og slangegift VEGF, pluss andre hemmendeisoformer av VEGF-A) 2.
Disse ligander interagere med tre medlemmer av reseptor-tyrosin-kinase-familien, nemlig VEGFR-1, VEGFR-2 og VEGFR-3. Disse reseptorer er variabelt uttrykt på forskjellige celletyper, men som ofte er ko-uttrykt på overflaten til endoteliale cellene som kler blod og lymfekar av alle størrelser 5. VEGFR-2 kan binde pattedyr ligander VEGF-A 6, VEGF-C 7 og VEGF-D 8,9 samt orf virus VEGF 10 og slangegift VEGF 11. VEGFR-2 spiller en stor rolle i å drive angiogenese (vekst av nye blodkar fra eksisterende fartøy) i fosterutviklingen, sårheling, kreft og øyesykdommer. I disse sammenhenger, ligander så som VEGF-A, -C og -D binder og aktiverer reseptoren på blod vaskulære endotelceller 12-15. På lymfatiske endotelceller, spiller VEGFR-2-en rolle i lymphangiogenesis, dannelsen av nye lymfekar 16. VEGFR-2 kan også fremme utvidelse og utbygging av store arterier og lymfekar i friskt vev og sykdom 17. En fullstendig forståelse av VEGFR-2: ligand interaksjoner er derfor viktig for utvikling av inhibitorer for anvendelse ved behandling av angiogenese-avhengige sykdommer 18. Mens de fleste isoformer av VEGF-A binder til VEGFR-2, proteolytisk spalting av VEGF-C og VEGF-D nødvendig for å frigjøre et fragment som består av VEGF-homologi domene som oppviser høy affinitetsbinding til VEGFR-2 19,20.
Vi har utviklet en bioassay å overvåke ligander av VEGFR-2 som er designet for å omgå behovet for primære endotelceller, som er teknisk vanskelig å passasje, dyrt å kjøpe og kultur (som krever spesialisert medium) 21 og uttrykke flere VEGFRs og tilhørende co- reseptorer 22. Heterodimerisering av VEGFR-2 med andre VEGF reseptorer eller co-reseptorer kan føre til uønsket kompleksitet når som mål å study binære reseptor-ligand interaksjoner, evaluere aktivitet som kan tilskrives en spesifikk reseptor, eller vurdere effekten av inhiberende reagenser. 23. Bioanalysen beholder mobiliteten av det relevante reseptorer i cellemembranen og tillater evaluering av en ligand evne til å binde og tverrbinde VEGFR-2 ekstracellulære region.
Bioanalysen er avhengig av etablering av en kimær reseptor i hvilken det ekstracellulære område av en VEGF-reseptor (i dette tilfellet VEGFR-2) er fusjonert til det transmembrane og intracellulære områdene av erytropoietinreseptoren (Epor), et medlem av cytokin-reseptor-familien 8,24. Dette fusjonsprotein blir deretter uttrykt i faktor-avhengige pro-B cellelinje Ba / F3, hvorpå stimulering med en ligand som er i stand til binding og tverrbinding av det ekstracellulære domene av reseptoren fører til aktivering av det cytoplasmatiske effektor-regionen, som er i stand av transducing en overlevelsessignal via Janus kinaser (Jaks) for å fremme celleoverlevelse og / eller spredning. I motsetning til ekspresjon av full-lengde VEGFR-2 i den samme celletype, og stimulering med ligand, ikke fremmer celleoverlevelse og proliferasjon, noe som indikerer at de proksimale signal effektorer av VEGFR-2 veien ikke er tilgjengelig i denne celletype.
Vi har brukt til analysen i en rekke sammenhenger for å utforske binding av nye VEGFR-2 ligander 10,19,20,24-29. I kombinasjon med en VEGFR-3-Epor-Ba / F3 analysen har vi sammenliknet de relative aktiviteter av VEGF-C og VEGF-D vekstfaktorer for binding og kryssbinding VEGFR-2 og VEGFR-3 30. Analysen har blitt brukt for å karakterisere den hemmende aktiviteten av nøytraliserende monoklonale antistoffer til VEGFR-2 eller VEGF-D, oppløselige VEGFR-2-felle og peptidomimetika som målrettes mot VEGF-familien 31. Analysen ble også benyttet for å vise evnen til VEGFs fra forskjellige orf virusstammer til å binde og tverrbinde VEGFR-2 før testing i primære endotelceller <sopp> 10,26. Analysen er spesielt nyttig for rask screening av mutanter av VEGFs som hurtig kan vurderes for aktivitet før de blir introdusert til den mer arbeidskrevende endotelial celleanalyser 25 eller ved vurderingen av protokoller for rensing av vekstfaktorer 27.
Analysen vi beskriver er lett å utføre, og den semi-kvantitative versjon muliggjør rask bestemmelse som noen ganger er nødvendig når overvåking av produksjon eller rensing av vekstfaktorer, antistoffer eller løselige reseptor domener for andre eksperimenter. Brukervennligheten av analysen gjør det til et ideelt supplement til videre og mer komplette studier utført med primære endotelceller avledet fra blod eller lymfekar fra bestemte vev eller organsystemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analysen som beskrives her er avhengig av anvendelse av celler med høy levedyktighet, som er avhengige av vekstfaktorer. Celler må derfor være nøye dyrkes for å sikre at de er faktor-avhengige, og beholde uttrykk for kimære reseptor. Sikre at mediet er rykende fersk og ikke lagres over en svært lang periode, og at WEHI-3D CM er svært aktiv er viktig. Cellene må være grundig vasket fra IL-3-inneholdende medium inn i analysemedium for å sikre at ingen rester av IL-3 forurenser analysen ved å eksponere ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.
Materials
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | N/A | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | N/A | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
References
- Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
- Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
- Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
- Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
- Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
- Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
- Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
- Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
- Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
- Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
- Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
- Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
- Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
- Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
- Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
- Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
- Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
- Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
- Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
- McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
- Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
- Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
- Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
- Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
- Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
- Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
- Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
- Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
- Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
- Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
- Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
- Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).
