En enkel Bioanalys för utvärdering av Vascular Endothelial Growth Factors
Summary
Vi beskriver en enkel cellbaserad bioanalys för detektion, kvantifiering och övervakning av aktiviteten hos medlemmar av vascular endothelial growth factor familj av ligander. Analysen använder chimära receptorer som uttrycks i en faktorberoende cellinje för att åstadkomma en semi-kvantitativ eller kvantitativ bedömning av receptorbindning och tvärbindning genom liganden.
Abstract
Analysen av receptortyrosinkinaser och deras samverkande ligander involverade i vaskulär biologi är ofta utmanande på grund av det konstitutiva uttrycket av familjer av besläktade receptorer, ett brett spektrum av relaterade ligander och svårigheten att hantera primära kulturer av specialiserade endotelceller. Här beskriver vi en bioanalys för detektering av ligander till vaskulär endotelial tillväxtfaktorreceptor-2 (VEGFR-2), ett nyckelomvandlare av signaler som främjar angiogenes och lymfangiogenes. Ett cDNA som kodar för en fusion av den extracellulära (ligandbindande) området av VEGFR-2 med de transmembrana och cytoplasmiska regionerna av erytropoietinreceptorn (EpoR) uttrycks i den faktor-beroende cellinjen Ba / F3. Denna cellinje växer i närvaro av interleukin-3 (IL-3) och indragning av denna faktor resulterar i död av cellerna inom 24 timmar. Expression av VEGFR-2 / EpoR receptorfusions ger en alternativ mekanism för att främja överlevnad och potentially proliferation av stabilt transfekterade Ba / F3-celler i närvaro av en ligand med förmåga att binda och tvärbinda den extracellulära delen av fusionsproteinet (dvs., en som kan tvärbinda den VEGFR-2 extracellulära regionen). Analysen kan utföras på två sätt: en semi-kvantitativ metod där små volymer av ligand och celler medger snabb följd i 24 timmar, och en kvantitativ metod som innebär surrogatmarkörer av en livskraftig cell nummer. Analysen är relativt lätt att utföra, är mycket mottaglig för kända VEGFR-2-ligander och kan rymma extracellulära inhibitorer av VEGFR-2 signalering såsom monoklonala antikroppar till receptorn eller ligander och lösliga liganden fällor.
Introduction
Den vaskulära endoteliala tillväxtfaktor (VEGF) -familjen av utsöndrade protein tillväxtfaktorer och deras besläktade cellytereceptorer är en viktig och mångskiftande grupp av lösliga ligander och membraninbäddade receptorer, respektive den funktionen i transduktion av signaler över cellmembran. De fungerar huvudsakligen i endotelceller utan även i celler av epitelialt ursprung och de som av immunsystemet 1,2. Signalvägar som anlitas av ligand-aktiverade VEGF-receptorer (VEGFRs) är kritiska i stora sjukdomar, såsom åldersrelaterad makuladegeneration och cancer, och terapi riktar dem är ofta klinisk användning (t.ex. den monoklonala antikroppen bevacizumab som riktar VEGF-A) 3,4.
En av komplexiteten av VEGF-familjen är den mångfald av lösliga ligander närvarande i naturen (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-proteiner som kodas av parapox virusfamiljen ORF och ormgift VEGF, plus andra hämmandeisoformer av VEGF-A) 2.
Dessa ligander interagerar med tre medlemmar av receptortyrosinkinas familjen, nämligen VEGFR-1, VEGFR-2 och VEGFR-3. Dessa receptorer är variabelt uttrycks på olika celltyper, men ofta co-uttrycks på ytan av endotelceller som bekläder blod och lymfkärl i alla storlekar 5. VEGFR-2 kan binda däggdjurs ligander VEGF-A 6, VEGF-C 7 och VEGF-D 8,9 samt orf virus VEGF 10 och ormgift VEGF 11. VEGFR-2 spelar en viktig roll för att driva angiogenes (tillväxten av nya blodkärl från redan existerande kärl) i embryonal utveckling, sårläkning, cancer och ögonsjukdomar. I dessa sammanhang, ligander såsom VEGF-A, -C och -D binda och aktivera receptorn på blod vaskulära endotelceller 12-15. På lymfatiska endotelceller, VEGFR-2 spelar en roll i lymfangiogenes, bildandet av nya lymfkärl 16. VEGFR-2 kan också främja utvidgning och utbyggnad av stora artärer och lymfkärl i friska vävnader och sjukdomar 17. En fullständig förståelse av VEGFR-2: ligandinteraktioner är därför viktigt för utvecklingen av inhibitorer för användning vid behandling av angiogenesberoende sjukdomar 18. Medan de flesta isoformerna av VEGF-A binder till VEGFR-2, är proteolytisk klyvning av VEGF-C och VEGF-D krävs för att frigöra ett fragment som består av VEGF-homologidomän som uppvisar hög affinitetsbindning till VEGFR-2 19,20.
Vi har utvecklat en bioanalys för att övervaka ligander av VEGFR-2 som är utformade för att kringgå behovet av primära endotelceller, som är tekniskt svårt att passage, dyrt att köpa och kultur (som kräver specialiserad medium) 21 och uttrycka flera VEGFRs och tillhörande samarbete receptorer 22. Hetero av VEGFR-2 med andra VEGF-receptorer eller co-receptorer kan orsaka oönskad komplexitet när syftet är att study binära receptor-ligandinteraktioner, utvärdera aktivitet kan tillskrivas en specifik receptor, eller bedöma effekten av hämmande reagens. 23. Bioanalysen bibehåller rörligheten av den relevanta receptorn i cellmembranet och möjliggör utvärdering av en ligand förmåga att binda och tvärbinda VEGFR-2 extracellulära regionen.
Bioanalysen förlitar sig på skapandet av en chimär receptor i vilken den extracellulära regionen av en VEGF-receptor (i detta fall VEGFR-2) är sammansmält med transmembran- och intracellulära regioner av erytropoietinreceptorn (EpoR), en medlem av den cytokinreceptorfamiljen 8,24. Detta fusionsprotein uttrycks sedan i den faktor-beroende pro-B-cellinje Ba / F3, på vilken stimulering med en ligand med förmåga att binda och tvärbinda den extracellulära domänen av receptorn orsakar aktivering av den cytoplasmatiska effektor-regionen, som har förmåga att transducera en överlevnadssignal via januskinas (Jaks) att främja cellöverlevnad och / eller proliferation. I motsats, uttryck av fullängds-VEGFR-2 i samma celltyp, och stimulering med ligand, inte främjar cellöverlevnad och -proliferation, vilket indikerar att de proximala signalerings effektorer av VEGFR-2-vägen är inte tillgängliga i denna celltyp.
Vi har använt analysen i en mängd olika sammanhang för att undersöka bindning av nya VEGFR-2-ligander 10,19,20,24-29. I kombination med en VEGFR-3-EpoR-Ba / F3-analysen har vi jämfört de relativa aktiviteterna av VEGF-C och VEGF-D faktorer tillväxt för bindning och tvärbindning VEGFR-2 och VEGFR-3 30. Analysen har använts för att karaktärisera den inhiberande aktiviteten av neutraliserande monoklonala antikroppar till VEGFR-2 eller VEGF-D, löslig VEGFR-2-fälla och peptidomimetika som riktar VEGF-familjen 31. Analysen användes också för att visa förmågan hos VEGFs från olika stammar ORF virus att binda och tvärbinda VEGFR-2 före testning i primära endotelceller <supp> 10,26. Analysen är särskilt användbar för snabb screening av mutanter av VEGFs som snabbt kan bedömas för aktivitet innan de införs till de mer mödosamma endotel cellanalyser 25 eller vid bedömningen protokoll för rening av tillväxtfaktorer 27.
Analysen vi beskriver är lätt att utföra, och semi-kvantitativ version möjliggör snabba bestäm som ibland krävs vid övervakning av produktionen eller rening av tillväxtfaktorer, antikroppar eller lösliga receptordomäner för andra experiment. Den enkla användningen av analysen gör det till ett idealiskt komplement till ytterligare och mer kompletta studier utförda med primära endotelceller härledda från blod eller lymfkärl från specifika vävnader eller organsystem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den analys som beskrivs här förlitar sig på användning av celler med hög livsduglighet, som är beroende av tillväxtfaktorer. Celler måste därför vara noggrant odlas för att säkerställa att de är faktorberoende, och behålla uttryck av den chimära receptorn. Att se till att mediet nyligen gjort och inte lagras under en alltför lång tid och att WEHI-3D CM är högaktiv är viktigt. Celler måste noggrant tvättas från IL-3-innehållande medium in i analysmediet för att säkerställa att ingen kvar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.
Materials
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | N/A | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | N/A | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
References
- Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
- Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
- Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
- Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
- Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
- Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
- Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
- Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
- Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
- Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
- Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
- Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
- Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
- Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
- Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
- Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
- Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
- Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
- Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
- McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
- Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
- Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
- Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
- Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
- Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
- Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
- Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
- Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
- Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
- Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
- Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
- Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).
