ИСТИНА молчанием генов: Скрининг гептамер типа Руководство Малые РНК библиотека для потенциальных рака терапевтических агентов
Summary
Здесь мы приводим протокол для скрининга библиотеки sgRNA гептамер типа для потенциальных терапевтических препаратов против рака крови.
Abstract
ИСТИНА ген глушителей (называемый после того, как Tr Nase Z L – и tilizing е fficacious ген глушителей) является одним из РНК-направленной молчанием генов технологии, которая использует искусственный небольшой путеводитель РНК (sgRNA) для направления обработки эндорибонуклеазу Трнк 3 ', tRNase Z L , чтобы распознать РНК-мишени. sgRNAs может захватываться клетками без каких-либо реагентов трансфекции и могут подавляют их уровни РНК-мишени и / или индуцировать апоптоз в раковых клетках человека. Мы скринингу библиотеку sgRNA, содержащую 156 sgRNAs гептамер типа для влияния на жизнеспособность клеток костного мозга и клеток лейкемии человека, и обнаружили, что 20 из них могут эффективно индуцировать апоптоз по меньшей мере, одной из линий раковых клеток. Здесь мы приводим протокол для скрининга библиотеки sgRNA гептамер типа для потенциальных терапевтических препаратов против рака крови. Протокол включает в себя, как построить библиотеку sgRNA, как оценить влияние каждого sgRNA на жизнеспособность клеток, и как фуrther оценить эффективные sgRNAs с помощью проточной цитометрии. Около 2000 хитов, как ожидается, будут получены путем скрининга полномасштабной sgRNA библиотеку, состоящую из 16384 гептамеров.
Introduction
ИСТИНА ген глушителей (называемый после того, как Tr Nase Z L – U tilizing е fficacious ген глушителей) является одной из РНК-направленной молчанием генов технологий 1. Эта технология была разработана на основе свойств tRNase Z L (или 3 'tRNase), т – РНК 3' обработки эндорибонуклеазу: он может расщеплять любую РНК – мишень в любой ожидаемой площадке под руководством искусственного небольшой направляющей РНК (sgRNA) признавалось бы предварительно тРНК-подобных или микро-пре-тРНК-подобную структуру , образованную между РНК – мишени и 2 sgRNA – 9. sgRNA, которая, как правило, 7-31 нт в длину, подразделяется на четыре группы, 5'-половины тРНК, гептамер РНК, 14-нт линейной РНК, и крючок РНК.
Мы продемонстрировали эффективность ИСТИНА молчанием генов путем введения различных искусственно разработанных sgRNAs в живые клетки 10 – 15. Мы также показали, что sgRNAs могут быть приняты клетками Wiбез промежуточного каких – либо реагентов трансфекции и могут их уровни подавляют РНК – мишени и / или индуцировать апоптоз в раковых клетках человека 16 – 18. ИСТИНА ген глушителей , кажется, работает на внутри- и системы регулирующей сети межклеточное генов через tRNase Z L и природных sgRNAs 19 – 21.
Мы построили библиотеку , содержащую sgRNA 156 sgRNAs гептамер типа для поиска потенциальных sgRNAs терапевтических гептамер типа для рака 22 крови. Мы просеивают его влияния на жизнеспособность клеток костного мозга и клеток лейкемии человека, и обнаружили, что 20 из них могут эффективно индуцировать апоптоз по меньшей мере, одной из линий раковых клеток. И 4 из них было показано снижение темпов роста опухоли у мышей ксенотрансплантатных экспериментов.
Здесь мы приводим протокол для скрининга библиотеки sgRNA гептамер типа для потенциальных терапевтических препаратов против рака крови. Протокол включает в себя какпостроить библиотеку sgRNA, как оценить влияние каждого sgRNA на жизнеспособность клеток, и как дальше оценить эффективную sgRNAs с помощью проточной цитометрии. Анализ клеточных мишеней РНК sgRNA и оценка эффективных sgRNAs в мышиных моделях ксенотрансплантатов может быть выполнена в соответствии с обычными способами , 17,22, хотя они не включены в данном протоколе.
Protocol
Representative Results
Discussion
In most cases, fully 2′-O-methylated, 5′- and 3′-phosphorylated heptamer-type sgRNAs dissolved in water-for-injection-grade water (in the concentration of 100 µM) appear to be stable at below -20 °C for at least one year, judging from their activity to induce apoptosis in cancer cells. However, their stability would change depending on their sequence, quality, and purity. In some cases, 5′- or 3′-phosphate of a part of sgRNA molecules appears to be removed spontaneously du…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана адаптируемой и бесшовной технологии программы передачи через Target приводом R & D, Япония науки и технологии агентства, Научно-исследовательский фонд науки Продвижение от Корпорации по содействию и взаимной помощи для частных школ Японии, а числа ЯОРН KAKENHI Грант 24300342 и 15H04313 ,
Materials
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
References
- Scherer, L., Rossi, J. J., Morris, K. V. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. , 201-226 (2008).
- Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
- Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
- Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
- Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).
- Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
- Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
- Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
- Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
- Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
- Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
- Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9 (114121), (2014).
- Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7 (38496), (2012).
- Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
- Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
- Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908 (2009).
- Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
- Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631 (2015).
- Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
- Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729 (2014).
