TRUE Gene Silencing: Projection d'un heptamère type Petit Guide ARN Bibliothèque pour les agents thérapeutiques potentiels du cancer
Summary
Nous présentons ici un protocole de criblage d'une banque d'ARN sg de type heptamère pour les médicaments thérapeutiques potentiels contre les cancers du sang.
Abstract
Silençage génique TRUE (appelé après tR Nase Z L – u tilizing e fficacious silençage génique) est un gène d'ARN dirigée silencing technologies, qui utilise un petit ARN guide artificiel (ARN sg) pour guider ARNt 3 «traitement endoribonucléase, tRNase ZL de reconnaître un ARN cible. sgRNAs peuvent être absorbés par les cellules sans réactifs de transfection et peuvent réguler négativement les taux d'ARN cible et / ou induire l'apoptose dans les cellules cancéreuses humaines. Nous avons criblé une bibliothèque contenant ARNsg 156 sgRNAs type heptamère de l'effet sur la viabilité des cellules de myélome et de leucémie humaine, et ont découvert que 20 d'entre eux peuvent efficacement induire une apoptose dans au moins une des lignées cellulaires du cancer. Nous présentons ici un protocole de criblage d'une banque d'ARN sg de type heptamère pour les médicaments thérapeutiques potentiels contre les cancers du sang. Le protocole comprend comment construire la bibliothèque ARNsg, comment évaluer l'effet de chaque ARN sg sur la viabilité cellulaire, et comment fucomplémen évaluer les sgRNAs efficaces par cytométrie de flux. Environ 2.000 résultats seraient censés être obtenus par criblage de la banque d'ARN sg pleine échelle composée de 16.384 heptamères.
Introduction
Silençage génique TRUE (appelé après tR Nase Z L – u tilizing e fficacious silençage génique) est l' une des technologies de silençage génique ARN-1. Cette technologie a été développée en fonction des propriétés de tRNase Z L (ou 3 'tRNase), ARNt 3' traitement endoribonucléase: il peut cliver tout ARN cible sur un site prévu sous la direction d'un petit ARN guide artificiel (ARNsg) en reconnaissant un structure pré-ARNt ou un micro-pré-ARNt formé entre l'ARN cible et l'ARN sg 2-9. ARNsg, qui est habituellement 7-31 nt de long, sont classées en quatre groupes, 5'-demi-ARNt, l'ARN heptamère, un ARN linéaire 14-nt, et de l'ARN du crochet.
Nous avons démontré l'efficacité de silençage génique TRUE en introduisant divers sgRNAs artificiellement conçus dans des cellules vivantes 10 – 15. Nous avons également montré que sgRNAs peuvent être absorbés par les cellules wiThoout tous les réactifs de transfection et peuvent réguler négativement les taux d'ARN cible et / ou induire l' apoptose dans les cellules cancéreuses humaines 16 – 18. Silençage génique TRUE semble fonctionner sur le intracellulaire et le gène intercellulaire système de réseau de régulation via tRNase Z L et sgRNAs naturelles 19 – 21.
Nous avons construit une bibliothèque ARNsg contenant 156 sgRNAs de type heptamère pour rechercher thérapeutiques sgRNAs potentiels de type heptamère pour les cancers du sang 22. Nous avons criblé pour l'effet sur la viabilité des cellules de myélome et de leucémie humaine, et ont découvert que 20 d'entre eux peuvent efficacement induire une apoptose dans au moins une des lignées cellulaires du cancer. Et 4 d'entre eux ont été montré pour réduire les taux de croissance de la tumeur dans les expériences de xénogreffe de souris.
Nous présentons ici un protocole de criblage d'une banque d'ARN sg de type heptamère pour les médicaments thérapeutiques potentiels contre les cancers du sang. Le protocole comprend commentpour construire la bibliothèque ARNsg, comment évaluer l'effet de chaque ARN sg sur la viabilité cellulaire, et la façon d'évaluer davantage les sgRNAs efficaces par cytométrie en flux. Analyse pour ARN cibles cellulaires de ARNsg et l' évaluation des sgRNAs efficaces dans des modèles de xénogreffes de souris peuvent être effectuées selon des méthodes classiques 17,22, bien que ceux – ci ne sont pas inclus dans ce protocole.
Protocol
Representative Results
Discussion
In most cases, fully 2′-O-methylated, 5′- and 3′-phosphorylated heptamer-type sgRNAs dissolved in water-for-injection-grade water (in the concentration of 100 µM) appear to be stable at below -20 °C for at least one year, judging from their activity to induce apoptosis in cancer cells. However, their stability would change depending on their sequence, quality, and purity. In some cases, 5′- or 3′-phosphate of a part of sgRNA molecules appears to be removed spontaneously du…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Programme de transfert Adaptable et de la technologie Seamless par la R & D, la technologie Agence japonaise pour la science et le Fonds de promotion de la recherche en sciences de la Société de promotion et d'aide mutuelle pour les écoles privées du Japon Target-driven, et les numéros JSPS KAKENHI Grant 24300342 et 15H04313 .
Materials
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
References
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