TRUE Gene Silencing: Screening van een heptameer-type Kleine Gids RNA bibliotheek voor potentiële Cancer Therapeutische Agents
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het screenen van een heptameer-type sgRNA bibliotheek voor potentiële therapeutische geneesmiddelen tegen bloedkanker.
Abstract
TRUE genuitschakeling (genoemd na tR Nase ZL – u tilizing e fficacious genuitschakeling) is een van de RNA-gerichte gen silencing technieken, die een kunstmatige geleidepen RNA (sgRNA) ingezet om tRNA 3 'verwerking endoribonuclease, tRNase ZL gids , een doel-RNA te herkennen. sgRNAs kunnen door cellen worden zonder transfectie reagentia en hun doel-RNA niveaus downreguleren en / of apoptose in humane kankercellen. We hebben een sgRNA bibliotheek met 156 heptameer type sgRNAs voor het effect op de levensvatbaarheid van humane myeloma en leukemie cellen onderzocht en vonden dat 20 ze efficiënt apoptose in ten minste één van de kanker cellijnen kan induceren. Hier presenteren we een protocol voor het screenen van een heptameer-type sgRNA bibliotheek voor potentiële therapeutische geneesmiddelen tegen bloedkanker. Het protocol bevat hoe de sgRNA bibliotheek te construeren, hoe het effect van elke sgRNA op de levensvatbaarheid van de cellen, en te beoordelen hoe om te further evalueren effectieve sgRNAs met flowcytometrie. Rond 2000 treffers zou naar verwachting worden verkregen door het screenen van de full-scale sgRNA bibliotheek bestaat uit 16.384 heptameren.
Introduction
TRUE genuitschakeling (genoemd na tR Nase ZL – u tilizing e fficacious genuitschakeling) is een van de RNA-gerichte gene silencing technologie 1. Deze technologie werd ontwikkeld op basis van eigenschappen van tRNase ZL (of 3 'tRNase), tRNA 3' verwerking endoribonuclease: het kan elke doel-RNA op een verwachte plaats splitsen onder leiding van een kunstmatige geleidepen RNA (sgRNA) door het herkennen pre-tRNA-achtige of micro-pre-tRNA-achtige structuur gevormd tussen het doelwit-RNA en sgRNA 2-9. sgRNA, dat gewoonlijk 7-31 nt lang is onderverdeeld in vier groepen, 5'-half-tRNA, heptameer RNA, 14-nt lineair RNA en RNA haak.
We hebben de effectiviteit van TRUE gene silencing aangetoond door de invoering van verschillende kunstmatig ontworpen sgRNAs in levende cellen 10-15. We hebben ook aangetoond dat sgRNAs kan worden opgenomen door cellen without elke transfectiereagentia en kunnen hun doelwit RNA-spiegels downregulate en / of apoptose in menselijke kankercellen 16-18. TRUE genuitschakeling lijkt te werken op de intracellulaire en intercellulaire genregulerend netwerksysteem via tRNase ZL en natuurlijke sgRNAs 19-21.
We hebben een sgRNA bibliotheek met 156 heptameer-type sgRNAs geconstrueerd om te zoeken naar potentiële therapeutische heptameer-type sgRNAs voor bloedkanker 22. We hebben het gescreend op het effect op de levensvatbaarheid van humane myeloma en leukemie cellen en vonden dat 20 ze efficiënt apoptose in ten minste één van de kanker cellijnen kan induceren. En 4 ervan is aangetoond dat tumorgroeisnelheden in muis xenograft experimenten verminderen.
Hier presenteren we een protocol voor het screenen van een heptameer-type sgRNA bibliotheek voor potentiële therapeutische geneesmiddelen tegen bloedkanker. Het protocol bevat hoehet sgRNA construeren, hoe het effect van elke sgRNA op cellevensvatbaarheid en hoe de effectieve sgRNAs verdere beoordeling door flowcytometrie beoordelen. Analyse voor sgRNA de cellulaire doelwit RNA en evaluatie van effectieve sgRNAs in muizen xenograft modellen kan worden uitgevoerd volgens conventionele werkwijzen 17,22, hoewel deze niet in dit protocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
In most cases, fully 2′-O-methylated, 5′- and 3′-phosphorylated heptamer-type sgRNAs dissolved in water-for-injection-grade water (in the concentration of 100 µM) appear to be stable at below -20 °C for at least one year, judging from their activity to induce apoptosis in cancer cells. However, their stability would change depending on their sequence, quality, and purity. In some cases, 5′- or 3′-phosphate of a part of sgRNA molecules appears to be removed spontaneously du…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door flexibele en naadloze Technology Transfer Program via Target-gedreven R & D, Japan Science and Technology Agency, de Science Research Stimuleringsfonds voor de actie en de Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan, en de JSPS KAKENHI Grant Numbers 24300342 en 15H04313 .
Materials
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
References
- Scherer, L., Rossi, J. J., Morris, K. V. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. , 201-226 (2008).
- Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
- Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
- Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
- Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).
- Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
- Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
- Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
- Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
- Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
- Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
- Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9 (114121), (2014).
- Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7 (38496), (2012).
- Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
- Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
- Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908 (2009).
- Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
- Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631 (2015).
- Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
- Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729 (2014).
