TRUE Gene Silencing: Screening af en heptamer-typen Lille guide RNA Bibliotek for potentielle kræft terapeutiske midler

Summary

Her præsenterer vi en protokol til screening af en heptamer-typen sgRNA bibliotek for potentielle terapeutiske lægemidler mod blodkræft.

Abstract

TRUE gendæmpning (betegnet efter tR Nase Z ^L – u tilizing e fficacious gendæmpning) er en af RNA-rettede gen silencing teknologier, som anvender en kunstig lille guide RNA (sgRNA) til at guide tRNA 3'forarbejdning endoribonuclease, tRNase Z ^L at anerkende et mål RNA. sgRNAs kan optages af celler uden transfektionsreagenser og kan nedregulere deres mål-RNA-niveauer og / eller inducere apoptose i humane cancerceller. Vi har screenet en sgRNA bibliotek indeholdende 156 heptamer-type sgRNAs for virkningen på levedygtigheden af ​​humane myelom og leukæmiceller, og fandt, at 20 af dem effektivt kan inducere apoptose i mindst en af ​​de cancercellelinjer. Her præsenterer vi en protokol til screening af en heptamer-typen sgRNA bibliotek for potentielle terapeutiske lægemidler mod blodkræft. Protokollen indeholder hvordan at konstruere sgRNA biblioteket, hvordan at vurdere effekten af ​​hver sgRNA på celle levedygtighed, og hvordan man further evaluere de effektive sgRNAs ved flowcytometri. Omkring 2.000 hits ville forventes at opnås ved screening i fuld skala sgRNA bibliotek bestående af 16.384 heptamerer.

Introduction

TRUE gendæmpning (betegnet efter tR Nase Z ^L – u tilizing e fficacious gendæmpning) er en af de RNA-dirigerede gene silencing teknologier ^1. Denne teknologi er blevet udviklet på baggrund af egenskaber tRNase Z ^L (eller 3 'tRNase), tRNA 3 »behandling endoribonuclease: det kan kløve enhver target RNA ved enhver forventet sted under ledelse af en kunstig lille guide RNA (sgRNA) ved at anerkende en pre-tRNA-lignende eller mikro-pre-tRNA-lignende struktur dannet mellem mål-RNA og sgRNA ^{2 – 9.} sgRNA, som normalt er 7-31 nt i længde, er kategoriseret i fire grupper, 5'-halv-tRNA, heptamer RNA, 14-nt lineær RNA, og krog RNA.

Vi har påvist effektiviteten af TRUE gendæmpning ved at indføre forskellige kunstigt designede sgRNAs i levende celler ^{10 – 15.} Vi har også vist, at der kan optages sgRNAs af celler without eventuelle transfektionsreagenser og kan nedregulere deres mål-RNA-niveauer og / eller inducere apoptose i humane cancerceller ^{16 – 18.} TRUE gendæmpning synes at arbejde på den intracellulære og intercellulære gen regulatoriske netværk system via tRNase Z ^L og naturlige sgRNAs ^{19 – 21.}

Vi har konstrueret en sgRNA bibliotek, der indeholder 156 heptamer-type sgRNAs at søge efter potentielle terapeutiske heptamer-type sgRNAs for blodkræft ^22. Vi har screenet det for virkningen på levedygtigheden af ​​humane myelom og leukæmiceller, og fandt, at 20 af dem effektivt kan inducere apoptose i mindst en af ​​de cancercellelinjer. Og 4 af dem har vist sig at reducere tumor vækst i mus xenograft eksperimenter.

Her præsenterer vi en protokol til screening af en heptamer-typen sgRNA bibliotek for potentielle terapeutiske lægemidler mod blodkræft. Protokollen indeholder hvordanat konstruere sgRNA biblioteket, hvordan at vurdere effekten af ​​hver sgRNA på celle levedygtighed, og hvordan man yderligere at evaluere de effektive sgRNAs ved flowcytometri. Analyse for sgRNA cellulære mål-RNA'er og evaluering af effektive sgRNAs i muse xenograftmodeller kan udføres ifølge traditionelle fremgangsmåder ^17,22, skønt disse ikke er inkluderet i denne protokol.

Protocol

1. Konstruktion af en heptamer-typen sgRNA Bibliotek Vælge en delmængde af de 16.384 (4 7) 7-nt-sekvenser medmindre fuldskala bibliotek skal bygges. BEMÆRK: Sekvenserne kan være tilfældige og / eller designet til at målrette specifikke cellulære RNA. For sidstnævnte finde hårnålestrukturer ligner T-arm tRNA i et mål-RNA ved hjælp af et passende computerprogram og / eller visuelt, og vælge sekvenserne komplementære til 7-nt-sekvenser umiddelbart nedstrøms for hårnålestrukture…

Representative Results

De seks heptamer-type sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), og 5'-CACCAGC-3' (H13260) blev kemisk syntetiseret som 2'-O-methyl RNA indeholdende 5'- og 3'-phosphater. Disse sgRNAs blev undersøgt for virkninger på levedygtighed af en human leukæmi cellelinje, HL60, og en h…

Discussion

In most cases, fully 2′-O-methylated, 5′- and 3′-phosphorylated heptamer-type sgRNAs dissolved in water-for-injection-grade water (in the concentration of 100 µM) appear to be stable at below -20 °C for at least one year, judging from their activity to induce apoptosis in cancer cells. However, their stability would change depending on their sequence, quality, and purity. In some cases, 5′- or 3′-phosphate of a part of sgRNA molecules appears to be removed spontaneously du…

Materials

Custom heptamer RNA	Nippon Bioservice
OligoSep Prep HC Cartridge	Transgenomic	99-3860
Water-for-injection-grade Water	Otsuka Pharmaceutical	7131400A2129
RPMI-1640 medium	Wako	189-02025
Fetal Bovine Serum	SIGMA-ALDRICH	172012-500ML
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution	Nacalai Tesque	26253-84
96 Well Plate	Greiner Bio-one	655 180
Cell Counting Kit-8	DOJINDO	343-07623	WST-8 solution
Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R	TEKAN	510-82851
FACS Round-Bottom Tube	BD Falcon	60819-820
Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	P7059-1L
PE Annexin V Binding Buffer	BD Biosciences	51-66121E
PE Annexin V	BD Biosciences	51-65875X
7AAD	SIGMA-ALDRICH	A9400-1MG
Flow Cytometer, FACSCalibur	BD Biosciences	342973