רקמת 3D משולב תכנון הנדסי<em> במבחנה</em> /<em> סיליקו</em> דגם גידול ריאות לניבוי יעילות טיפול תרופתי רקעים מוטציוני ספציפיים
Summary
We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.
Abstract
במחקר הנוכחי, שילבנו מודל גידול במבחנת 3D ריאות עם במודל סיליקון כדי לייעל תחזיות תגובת תרופה המבוססת על רקע מוטציה ספציפי. המודל שנוצר על פיגום חזירי decellularized שמעתיק מאפיינים רקמות ספציפיות לגבי הרכב תאי מטריקס ואדריכלות כולל קרום המרתף. קבענו סטנדרט פרוטוקול המאפשר דור רקמת גידול מלאכותי תוך 14 ימים, כולל שלושה ימים של טיפול תרופתי. המאמר שלנו מספק כמה תיאורים מפורטים של 3D לקריאה החוצה טכניקות הקרנה כמו הקביעה של מכתים Ki67 מדד התפשטות, אפופטוזיס מן supernatants ידי M30-ELISA והערכת אפיתל מעבר mesenchymal (EMT), אשר הם כלים שימושיים עבור הערכה האפקטיבית תרכובות טיפוליות. נוכל להראות לעומת תרבות 2D הפחתה של התפשטות במודל הגידול 3D שלנו כי הוא relatאד למצב הקליני. למרות התפשטות נמוכה זה, המודל ניבא EGFR תגובות סמי -targeted כראוי בהתאם למצב הסמן הביולוגי, כפי שמוצג על ידי השוואה של שורות תאי סרטן הריאות HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) ו- A549 (wild-type EGFR, KRAS – מוטציה) שטופלו במעכבי קינאז-טירוזין (gefitinib TKI). כדי לחקור תגובות תרופה של תאים סרטניים מתקדמים יותר, אנו מושרה EMT על ידי טיפול ארוך טווח עם TGF-beta-1 לפי הערכת vimentin / פאן-cytokeratin מכתים immunofluorescence. A-bioreactor תזרים הועסק להתאים תרבות לתנאים פיסיולוגיים, אשר שפרו דור רקמות. יתר על כן, אנו מציגים שילוב של תגובות התרופה על טיפול gefitinib או גירוי TGF-beta-1 – אפופטוזיס, מדד התפשטות EMT – לתוך בוליאני במודל סיליקון. בנוסף, אנו מסבירים כיצד תגובות תרופה של תאים סרטניים עם רקע מוטציה ספציפי וספירהerstrategies כנגד התנגדות ניתן לחזות. אנו בטוחים כי 3D שלנו בגישה במבחנה במיוחד עם צמיחתה סיליקון מספק ערך מוסף עבור בדיקות סמים פרה-קליניות בתנאים מציאותיים יותר מאשר תרבית תאי 2D.
Introduction
תעשיית התרופות ניצבת בפני שיעורי תשה גבוהים של עד 95% בתחום הטיפול בסרטן בשלב הקליני גרימת עלויות עצומות 1-5. אחת הסיבות לגירעון זה היא העובדה כי כיום יעילות של תרכובות חדשות הפוטנציאל נבחנת בהקרנות בקנה מידה גדול על תרביות תאים 2D של שורות תאים סרטניים או במודלים של בעלי חיים. במודלים של בעלי החיים יש מורכבות גבוהות אבל יש הבדלים מכריעים בין עכברים ואנשים 6,7. בעשור האחרון, מודלים סרטן 3D באמצעות גישות שונות נוצרו כדי לגשר על הפער בין תרבות 2D של שורות תאים סרטניים מתחם 6,8,9 הגידול vivo. ההשפעה של סביבת 3D על התמיינות תאים וגם על איתות הוכחה במספר מחקרים שנים (למשל., על ידי מינה ביסל) 10,11. היום, מודלים 3D תרבית תאים רבים זמינים כתרביות אליפטית, הידרוג או שבבי microfluidic 12-16. למרות thesמודלי דואר לשפר מורכבים לעומת מערכות תרבות 2D קונבנציונליות, הוא בעיקר חסר microenvironment רקמות כי הוא ידוע כבעל השפעות תומכות גידול וגם יעילות תרופה משפיעה.
כדי לטפל בבעיה זו, יצרנו מודל הגידול 3D מבוסס על פיגום ביולוגי הנקרא SISmuc (קטן-המעי-submucosa + רירית) כי נגזר מְעִי צָם חזירי decellularized. ובכך, ארכיטקטורת רקמות מרכיבים חשובים של ECM כגון collagens השונה, כמו גם את מבנה הקרום במרתף נשמרות 17. תכונה ייחודית זו היא קריטית עבור דור מודל גידול של קרצינומות העולות epithelia ומהווים כ -80% של גידולים מוצקים. יתר על כן, קצב התפשטות במודל גידול רקמות מהונדסות שלנו מצטמצם לעומת שיעור גבוה באופן מלאכותי מושגת בתרבות 2D. כמו התפשטות הוא פרמטר חשוב בהערכת יעילות התרופה, בדיקות סמים מופעלת במודל שלנו יותר דומהתנאי in vivo גידולי 17.
על מנת להעריך את הפוטנציאל של המודל שלנו לחזות יעילות התרופה תלויי סמן ביולוגי כראוי, אנחנו כאן מוצגים נתונים עבור שתי שורות תאים שונות ריאות סרטן שונים במעמד -biomarker EGFR שלהם. מצב מוטציוני זו החל שייקבע באופן שיגרתי בחולי NSCLC. טיפולים ממוקדים עם TKIs כגון EGFR -inhibitor gefitinib נגד גידולים הנושאים תוצאות טובות יותר צג מוטציה ב- EGFR הפעיל בהשוואה לאלו עם כימותרפיה על בסיס פלטינה 18-21.
הקמנו כמה טכניקות לקריאה החוצה שרלוונטיות להערכת יעילות מתחמת. יתר על כן, לאחר גירוי TGF-beta-1 אנו מסוגלים לחקור פעולות מתחמות בתאי גידול שהחלו בתהליך EMT, אשר נחשב צעד חשוב שינוי ממאיר 22,23 ואשר מחובר סמים ההתנגדce 24.
מודל גידול 3D לאפשר ניטור תגובות תא ספציפי לטיפולים ממוקדים, כימותרפיה, או שילובי תרופות עם ניגודים טובים. כדי לשפר עוד יותר ולהאיץ הקרנת סמים להיתקל בהתנגדות, זה הוא השלים ידי סימולציה סיליקון. בהתבסס על כמה ניסויים, תגובת הגידול ניתן לחזות ב סיליקו לגבי התוצאות עבור מגוון רחב של תרופות ושילובים שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
הקמנו בשילוב במבחנה / במערכת מבחן הגידול סיליקון לתחזיות טיפול מונחה סמן ביולוגי. המודל במבחנת מעריכת היבטים חשובים שונים של פעולות תרכובת כגון שינויים של ריבוי תאים סרטניים אפופטוזיס על רקע מוטציה ספציפי שיכול לעבור סימולצית סיליקו 17. כאן,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי המרכז למחקר קליני הבינתחומי (IZKF, BD247 מהענק) של בית החולים האוניברסיטאי של וירצבורג ותכנית Fit באיירן (שהוענקה היקה וואלס).
Materials
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | – | This software was used for drawing the network. |
| citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/l Citric acid monohydrate, 17.,6 g/l Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6,.0, stored at RT. | |
| citrate buffer working solution | in house production | 10 % Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | – | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal calf serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4 % (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3+M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37*3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27*2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37°C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | – | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
References
- Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29 (2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
- Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
- Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87 (2011).
- Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569 (2013).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
- Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170 (2015).
- Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels – Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9 (2015).
- Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
- Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
- Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
- Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
- Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
- Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
- Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
- Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
- Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
- . . Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , (2013).
- . . BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , (2015).
- Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
- Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
- Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277 (2006).
- Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).
