Immunomagnetische Trennung von Fett Depot-spezifische Sca1<sup> Hoch</sup> Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC)
Summary
We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.
Abstract
The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.
Introduction
Stammzell – Antigen 1 (Sca1 oder Ly6A / E) wurde zuerst als ein Zelloberflächenmarker von hämatopoetischen Stammzellen und mesenchymalen 5,6 ausgedrückt identifiziert. Die stromalen vaskulären Fraktion (SVF) von Fettgewebe aus Maus – Fettdepots erhalten ist eine heterogene Population von Zellen von Fibroblasten umfasst, Makrophagen, vaskulären Endothelzellen, Nervenzellen und Adipozyten Progenitorzellen 7. Adipocyte Vorläuferzellen oder Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASCS) sind nicht-lipidbeladenen Zellen , die in das Kollagen-reiche perivaskulärem extrazellulären Matrix (ECM) 8 befinden. Etwa 50% des SVF von ASCS bestehen, die als linien negativ charakterisiert sind (Lin -) und CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. Die meisten dieser Zellen sind Sca1 +: CD24 – Adipozyten – Progenitoren, die von Adipozyten – Differenzierung in vitro geeignet sind; jedoch nur ein Bruchteil der Zellen (0,08% SVF) bildet Sca1 <soben> +: CD24 + Zellen , die durchaus in der Lage vermehren und differenzieren zu Adipozyten in den in – vivo – Bedingungen 9 sind. Trotz der möglichen Einschränkung der ohne Unterscheidung CD24 + Zellen aus CD24 Sca1 + SVF mit – Zellen, Isolierung Sca1 + ASCS von Fettdepots immunomagnetischer Zelltrennung unter Verwendung ist eine effiziente und praktische Ansatz , um die zellautonome Phänotyp der primären Adipozyten Vorläuferzellen zu bestimmen.
Auf dem Gebiet der Adipositas und Diabetes, Gewebefibrose und Entzündungen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Wartung von Typ-2 – Diabetes 3 spielen. Vor kurzem Tokunaga et al. zeigten , dass von Leisten- isolierten High – Zellen Sca1 (oder subkutan, SQ) und perigonadal (oder viszerale, VIS) 10 verschiedene Gen – Signaturen und ECM – Umbau in vitro C57BL6 / J Fettdepots aufweisen. MMP14 (MT1-MMP), ein prototypisches Mitglied der membran typ Matrix – Metalloproteinase (MMP) Familie vermittelt die Entwicklung von weißen Fettgewebe (WAT) durch seine kollagenolytischer Aktivität 1.
Beispiele für Experimente , die mit den Zellen kann durch das folgende Protokoll sind die dreidimensionale Kultur, Differenzierung Studien, Kollagenabbau – Assays und RNA – Sequenzierung 10,11 isoliert und angereichert durchgeführt werden. Der Abbau Assays sollten mit Säure extrahierten Kollagen durchgeführt werden , um die Erhaltung der Telopeptid 11,12 zu gewährleisten. Das folgende Protokoll wird die Methoden nachweisen primären Zellen vaskuläre Stroma aus verschiedenen Fettdepots zu isolieren und zu Adipozyten-Vorläuferzellen unter Verwendung von immunomagnetischer Zelltrennung zu bereichern. Die Gültigkeit der Zellsortierung mit Fluss bewertet werden Zytometrie und durch den Einsatz von Sca1-GFP – Mäuse , die GFP in Sca1 + Zellen exprimieren, angetrieben durch einen Sca1 Promotor 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier zeigen wir die Isolierung und immunomagnetischer Zellseparation von murinen ASCS aus verschiedenen Fettpolster und deren Verwendung für die in – vitro – Experimenten. Die vorgestellte Methode ist wirksam für die schnelle Isolierung von großen Anzahl von Sca1-positive ASCS, die über die technisch aufwendige und teure FACS-vermittelte Isolierung von ASCS 9,14 vorteilhaft ist. Anders als FACS, ist immunomagnetischen Zelltrennung erlauben nicht die Verwendung von mehreren Antigen zur Id…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von NIH DK095137 (THC) unterstützt. Wir danken den aktuellen und ehemaligen Labor-Mitglieder, die an der Entwicklung und Verfeinerung der beschriebenen Verfahren beigetragen.
Materials
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
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