脂肪デポ固有のSca1の免疫磁気分離<sup>高</sup>脂肪由来幹細胞（ASCに）
Summary
We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.
Abstract
The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.
Introduction
細胞抗原1（のSca1、またはLy6A / E）の幹第造血および間葉系幹細胞5,6によって発現される細胞表面マーカーとして同定されました。マウス脂肪デポから得られた脂肪組織の間質の血管画分（SVF）は、線維芽細胞、マクロファージ、血管内皮細胞、神経細胞、および脂肪細胞前駆細胞の7を含む細胞の異種集団です。脂肪細胞の前駆細胞、または脂肪由来幹細胞（ASCには）、コラーゲンが豊富な血管周囲の細胞外マトリックス（ECM）8内に存在する非脂質を含んだ細胞です。 CD34 +：のSca1 + 9とCD29 + –約SVFの50％は、系統陰性（林）として特徴付けられるのASC、から構成されています。 ; in vitroでの脂肪細胞分化が可能である脂肪細胞前駆細胞、 – CD24：これらの細胞のほとんどはのSca1 +ですしかし、細胞の一部のみ（SVFの0.08％）がのSca1を構成します<sアップ> +：増殖性およびin vivoの条件9で脂肪細胞に分化を完全に行うことができますCD24 +細胞。 CD24からCD24 +細胞を区別することなくのSca1 + SVFを使用しての潜在的な警告にもかかわらず–免疫細胞分離を使用して、貯蔵脂肪からのSca1 +のASCを、細胞を単離一次脂肪細胞前駆細胞の細胞自律的な表現型を決定するための効率的かつ実用的なアプローチです。
肥満および糖尿病の分野では、組織線維症及び炎症が2型糖尿病3の発達および維持において重要な役割を果たしています。最近、徳永ら 。 （VIS、または内臓）鼠径部（または皮下、SQ）およびperigonadal C57BL6 / J脂肪デポから分離されたのSca1 high細胞は、in vitro 10 で異なる遺伝子署名およびECMリモデリングを示すことが示されました。 MMP14（MT1-MMP）、膜 – トンの原型メンバーYPEマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）ファミリーは、コラーゲン分解活性の1を介して、白色脂肪組織（WAT）の開発を仲介します。
以下のプロトコルを使用して単離され、濃縮された細胞を用いて行ってもよいの実験例は、三次元培養、分化研究、コラーゲン分解アッセイ、およびRNA配列10,11を含みます。分解アッセイは、テロペプチド11,12の保全を確実にするために、酸抽出コラーゲンで行われるべきです。次のプロトコルが異なる脂肪デポからの一次血管間質細胞を分離し、免疫磁気細胞分離を用いて、脂肪細胞の前駆細胞を豊かにする方法を紹介します。細胞選別の有効性は、フローサイトメトリーを用いてとのSca1プロモーター 13によって駆動されるのSca1 +細胞においてGFPを発現するのSca1-GFPマウスを用いによって評価されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで我々は分離と異なる脂肪パッドからマウスのASCの免疫細胞分離およびin vitro実験のためのそれらの使用を実証します。提示された方法は、ASCを9,14の技術的に複雑で高価なFACS媒介分離よりも有利で あるのSca1陽性のASCの多数の迅速な隔離のために有効です。 FACSは異なり、免疫細胞の分離は、標的細胞集団を同定するための多数の抗原の使用を許可しません。表面抗原…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、カンナビノール（THC）はNIH DK095137によってサポートされています。私たちは、記載された方法の開発と高度化に貢献して現在および過去の研究室のメンバーに感謝します。
Materials
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
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