Immunomagnetisk Separasjon av Fat Depot spesifikke Sca1<sup> høy</sup> adipose-avledet stamceller (ASC)
Summary
We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.
Abstract
The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.
Introduction
Stamcelle antigen 1 (Sca1, eller Ly6A / E) ble først identifisert som en celleoverflaten markør uttrykt av blodkreft og mesenchymale stamceller 5,6. Den stromal vaskulære fraksjon (SVF) av fettvev erholdt fra mus fettdepoter er en heterogen populasjon av celler omfatter fibroblaster, makrofager, vaskulære endoteliale celler, nerveceller, og adipocyttdifferensiering forløperceller 7. Adipocyte stamceller, eller adipose-avledet stamceller (ASCs) er ikke-lipid-laden celler som bor i kollagenrike perivaskulær ekstracellulære matriks (ECM) 8. Omtrent 50% av SVF består av ASCs, som er karakterisert som avstamning-negative (Lin -) og CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. De fleste av disse cellene er Sca1 +: CD24 – adipocyttuttrykte forløpere, som er i stand til adipocyttdifferensiering in vitro; imidlertid bare en brøkdel av celler (0,08% av SVF) utgjør Sca1 <sopp> +: CD24 + celler som er fullt ut i stand til prolifererende og differensiere til adipocytter i in vivo-betingelser 9. Til tross for potensialet forbeholdet om å bruke Sca1 + SVF uten å diskriminere CD24 + celler fra CD24 – celler, isolere Sca1 + ASCer fra fettdepoter ved hjelp immunomagnetisk celleseparasjon er en effektiv og praktisk metode for å bestemme celle-autonome fenotype av primær adipocyttuttrykte progenitorceller.
I feltet av fedme og diabetes, vev fibrose og inflammasjon spiller en avgjørende rolle i utviklingen og opprettholdelsen av type-2 diabetes 3. Nylig, Tokunaga et al. viste at Sca1 høye celler isolert fra lyske (eller subkutan, SQ) og perigonadal (eller visceral, VIS) C57BL6 / J fettdepoter viser ulike gen signaturer og ECM ombygging in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), en prototypiske medlemmer av den membran-type matriks-metalloproteinase (MMP) familie medierer utviklingen av hvite fettvev (WAT) gjennom sin kollagenolytisk aktivitet en.
Eksempler på forsøk som kan utføres med celler isolert og beriket gjennom den følgende protokoll omfatte tredimensjonal kultur, differensiering studier, kollagen degradering analyser, og RNA-sekvensering 10,11. Nedbrytnings analyser bør utføres med syre-ekstrahert kollagen for å sikre bevaring av telopeptid 11,12. Følgende protokoll vil demonstrere fremgangsmåter for å isolere primære vaskulære stromale celler fra forskjellige fettdepoter og berike adipocyttuttrykte progenitorceller ved å bruke immunomagnetisk celleseparasjon. Gyldigheten av cellen sortering vil bli vurdert med flowcytometri og gjennom å bruke Sca1-GFP mus som uttrykker GFP i Sca1 + celler, drevet av en Sca1 promoter 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heri vi viser til isolering og immunomagnetisk celleseparasjon av murine ASC fra forskjellige fettputer og deres anvendelse for in vitro eksperimenter. Den presenterte fremgangsmåten er effektiv for rask isolering av et stort antall Sca1-positive ASCer, noe som er fordelaktig i den teknisk komplisert og kostbar FACS-mediert isolering av ASCer 9,14. I motsetning til FACS, betyr immunomagnetisk celleseparasjon ikke tillate bruk av multippel antigen for identifikasjon av et mål-cellepopulasjon. Likeve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet støttes av NIH DK095137 (THC). Vi takker de nåværende og tidligere lab medlemmer som har bidratt til utvikling og raffinement av de beskrevne metoder.
Materials
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover. Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).
- Chun, T. H. Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis. Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).
- Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. Fibrosis and adipose tissue dysfunction. Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).
- Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Welm, B. E., et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).
- Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131 (2), 242-256 (2007).
- Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).
- Chun, T. H., Inoue, M. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover. Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).
- Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue. Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).
- Ong, W. K., et al. Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
