Summary

Étude Wnt Signaling Pendant Patterning de Conduite Airways

Published: October 16, 2016
doi:

Summary

L'utilisation de souris rapporteurs couplés à la montagne entière et section coloration, la microscopie et des essais in vivo facilite l'analyse des mécanismes sous – jacents la structuration normale des voies respiratoires. Ici, nous décrivons comment ces techniques ont contribué à l'analyse de la signalisation Wnt au cours du développement de la trachée.

Abstract

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

Introduction

Le développement des voies respiratoires est initiée par jour embryonnaire 9 (E9) avec l'apparition de cellules positives Nkx2.1 dans le endodermique ventral foregut 1,2. Tube de séparation oesophagien-trachéale résoudra par E11.5 lorsque les tubes peuvent être distingués comme des entités distinctes, chacune entourée d' un tissu mésenchymateuses 3. Wnt joue un rôle clé dans la description des voies respiratoires comme la suppression de Wnt2 et WNT2B, exprimé par le mesenchyme splanchnique et la suppression de β-caténine de l'épithélium respiratoire endodermique entraîne agenesis du poumon 4,5. Nos études antérieures ont déterminé que la suppression de Wls, un récepteur de chargement médiation de la sécrétion de tous les ligands Wnt, à partir des résultats des voies respiratoires dans endodermiques hypoplasie pulmonaire, des défauts dans le développement vasculaire pulmonaire et une mauvaise formation de motifs du mésenchyme trachéale 6,7. Ces données confirment l'importance de la cro épithéliale-mésenchymateusess parler dans la différenciation cellulaire et la spécification, comme il a également été démontré dans d' autres études 8,9.

L'étude des premiers stades du développement du poumon repose sur génétique, in vitro et ex vivo techniques qui nous ont permis de mieux comprendre les mécanismes d' entraînement identité respiratoire 10-16. Entières cultures d'explants du poumon à l'interphase liquide de l' air ont été largement utilisés pour étudier les effets de facteurs de croissance dans les premiers stades de ramification pulmonaire morphogenèse 10,17,18. Bien que cette méthode est utilisée en tant que lecture des changements morphologiques, tels que la morphogenèse de ramification, et la modulation de l' expression génique, il est limité à l'étude des premières étapes du processus de développement, car la culture elle – même ne supporte pas le développement du système vasculaire 17. Développement du cartilage trachéal nécessite de plus longues durées d'incubation qui peut-être pas compatible avec cette technique de culture.

Pour Analyze le rôle de la signalisation Wnt pendant la formation des voies respiratoires, nous avons adapté des techniques standard pour répondre aux besoins de nos études embryonnaires. Nous avons modifié les volumes, les temps de coloration, le vélo de traitement pour l'inclusion en paraffine et le calendrier pour la compensation du tissu trachéal-poumon. L'objectif principal d'optimiser les techniques décrites dans la présente étude était d'analyser les premiers stades du développement trachéale chez les souris qui ont lieu à partir de E11 à E14.5. Utilisation de la souris reporters ligne Axin2LacZ nous sites précisément déterminés de Wnt activité / β-caténine dans le trachéale mésenchyme en développement. Nous avons également adapté lectine procédure de coloration pour les tissus ensemble trachéale monture. Ainsi, nous avons pu visualiser condensations mésenchymateuses et de prédire les sites où chondrogenèse aura lieu. Coloration de la montagne ensemble et sections de tissus embryonnaires obtenues à partir de souris WlsShhCre, couplées avec des techniques de microscopie de pointe, nous a permis de dévoiler le rôle des ligands Wnt produits par le traépithélium trachéale en trachéale patterning.

Protocol

Les animaux ont été logés dans des conditions exemptes d'agents pathogènes. Les souris ont été traitées selon des protocoles approuvés par CCHMC Institutional Animal Care et utilisation Comité (Cincinnati, OH USA). Les souris utilisées au cours de ces études ont été maintenues dans un fond mixte. 1. Whole Mont X-galactosidase Coloration Euthanasier femme enceinte à E11.5 à E14.5, par inhalation de CO 2. Placez les animaux en CO 2 chambre, c…

Representative Results

Wnt activité / β-caténine Toute coloration mount Lac-Z a été détectée dans le tissu trachéal-poumon d'embryons isolés de journaliste Axin2 Lac -Z souris 11. Sites de coloration indiquent Wnt activité / β-caténine. L'analyse des coupes de toute coloration de montage a déterminé que l'activité Wnt / β-caténine est présent dans le mesenchyme de la trachée et…

Discussion

Evénements sous-tendent la morphogenèse des voies respiratoires ne sont pas complètement compris, en particulier les processus nécessaires à la structuration des voies aériennes. Des études antérieures ont utilisé des techniques ex vivo dans lequel explants en développement sont cultivées à l'interphase air-liquide ou incorporé dans matrigel 21,22. Ces études ont montré que les facteurs de croissance influent sur la formation de motifs de la trachée et le développement de la form…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous reconnaissons l'aide de Mike Muntifering et Matt Kofron avec l'imagerie confocale et Gail Macke avec les procédures histologiques. Ce travail a été partiellement financé par les Instituts nationaux de la santé-NHLBI (K01HL115447 DS).

Materials

Anti Sox9 ab. Millipore AB5535 1:400 , rabbit
Anti Sox9 ab. Santa Cruz Sc-20095 1:50, rabbit
Anti Smooth Muscle Actin ab. Sigma A5228 1:2k, mouse
Anti NKX2.1 ab. Seven Hills n/a 1:100, guinea pig
Anti NKX2.1 ab. Seven Hills n/a 1:400, mouse
Anti Brdu ab. Abcam AB1893 1:200, sheep
Anti Brdu ab. Santa Cruz Sc-32323 1:4k, mouse
PNA Lectin Sigma L 7381
Secondary antibodies Life technologies Alexa fluor Molecular probes
K3Fe(CN)6 Sigma P8131
K4Fe(CN)6 Sigma-Aldrich P3289
MgCl2 Sigma-Aldrich M9272
NaDOC Life Technologies 89905
NP4O Life Technologies 85124
Alcian Blue 8GX Sigma A-3157
Fisher brand super-frost plus Fisher 12-550-15
PFA (16%) EMS 15710
PBS Gibco 70011-044
Fetal Calf Serum Sigma 11K413
Blocking reagent Invitrogen Component of TSA kit #2    ( T20932)
BrDu Sigma B5002-5g
Vectashield mounting medium Vector labs H-1000
Permount Fisher SP15-500
Tissue-loc cassettes Histoscreen Fisher C-0250-GR
Biopsy cassettes Premiere BC0109 Available in different colors
Nuclear fast red  Kernechtrot 0.1% Sigma N3020
Citric acid Sigma C1909-500G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma S4641-1Kg
Trizma hydrochloride Sigma T5941-500G
Xylene Pharmco-AAPER 399000000
Ethanol Pharmco-AAPER 111000200
Micro knives FST 10318-14
Dumont #5 ceramic coated FST 11252-50
Dumont #5CO FST 11295-20
Dumont # 5 FST 91150-20
Thermo/Shandon Excelsior ES Thermo Fisher
Microtome Leica RM2135
Nikon i90 Nikon Wide field microscope
NikonA1Rsi Nikon Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10x. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. 
Leica MS 16 FA Leica Fluorescence Dissecting microscope
Zeiss Zeiss Automated fluorescence microscope
Leica Application suite Leica Leica imaging software
NIS Nikon Nikon imaging software
IMARIS Bitplane Imaging processing software

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Snowball, J., Ambalavanan, M., Sinner, D. Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways. J. Vis. Exp. (116), e53910, doi:10.3791/53910 (2016).

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