El uso de ratones reportero acoplados a todo el montaje y la sección de tinción, microscopía y ensayos in vivo facilita el análisis de los mecanismos que subyacen en el patrón normal de las vías respiratorias. A continuación se describe cómo estas técnicas contribuyeron al análisis de la señalización de Wnt durante el desarrollo traqueal.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
El estudio de la señalización Wnt Durante Patrones de llevar a cabo Airways
En este artículo
Resumen
Resumen
Wnt Las vías de señalización juegan un papel crítico durante el desarrollo del tracto respiratorio. Es necesario definir mecanismos precisos de diferenciación y morfogénesis controlados por la señalización Wnt para comprender cómo se modelan los tejidos durante el desarrollo normal. Este conocimiento también es fundamental para determinar la etiología de defectos congénitos como la hipoplasia pulmonar y la traqueobroncomalacia. El análisis de las etapas más tempranas del desarrollo de las vías respiratorias impone desafíos, ya que la cantidad limitada de tejido impide la realización de protocolos estándar más adecuados para los estudios postnatales. En este trabajo se discuten las metodologías para estudiar la diferenciación y proliferación celular en el tracto respiratorio. Describimos técnicas como la tinción de montaje completo, el procesamiento del tejido para microscopía confocal y la inmunofluorescencia en cortes de parafina aplicados al pulmón traqueal en desarrollo. También discutimos metodologías para el estudio de la diferenciación del mesénquima traqueal, en particular la formación de cartílago. Los enfoques y técnicas discutidos en el presente artículo eluden la limitación del material al trabajar con tejido embrionario, lo que permite una mejor comprensión del proceso de modelado del desarrollo de las vías respiratorias conductoras.
Introducción
El desarrollo del tracto respiratorio es iniciado por día embrionario 9 (E9) con la aparición de células positivas en el Nkx2.1 endodérmico ventral del intestino anterior 1,2. Separación del tubo esofágico-traqueal resolverá por E11.5 cuando los tubos se pueden distinguir como entidades distintas, cada una rodeada por tejido mesenquimal 3. La señalización de Wnt desempeña un papel clave en la especificación de las vías respiratorias como la supresión de Wnt2 y Wnt2b, expresada por el mesénquima esplácnico y supresión de β-catenina del epitelio respiratorio endodérmico resultará en agenesia pulmonar 4,5. Nues....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Los animales se alojaron en condiciones libres de patógenos. Los ratones fueron manejados de acuerdo a los protocolos aprobados por CCHMC Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (Cincinnati, OH EE.UU.). Los ratones utilizados a lo largo de estos estudios se mantuvieron en un fondo mixto.
1. Todo el montaje X-galactosidasa de tinción
- La eutanasia a mujer embarazada en E11.5 a E14.5, mediante inhalación de CO2. Colocar los animales en la cámara de CO 2, cargar la cámara con CO2. Mantener los animales en la cámara por un mínimo de 5 minutos. Realizar método secundario de la eutanasia....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
actividad / β-catenina vía
Se detectó tinción Whole mount Lac-Z en el tejido traqueal-pulmón de embriones aislados de reportero AXIN2 Lac -Z ratones 11. Sitios de tinción indican la actividad / β-catenina vía. El análisis de secciones de toda la tinción de montaje determinó que la actividad / β-catenina Wnt estaba presente en el mesénquima de la tráquea y en el mesénquima de las region.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Acontecimientos que subyacen a la morfogénesis de las vías respiratorias no se entienden completamente, en particular los procesos necesarios para el modelado de las vías aéreas de conducción. Estudios anteriores han utilizado técnicas ex vivo en el que se cultivan los explantes en desarrollo en la interfase aire-líquido o incrustado en matrigel 21,22. Estos estudios han demostrado que los factores de crecimiento influyen en el patrón de la tráquea y el desarrollo de la formación de cartílago traquea.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
"Los autores no tienen nada que revelar."
Agradecimientos
Reconocemos la ayuda de Mike y Matt Muntifering Kofron con la imagen confocal y Gail Macke con procedimientos histológicos. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud-NHLBI (K01HL115447 a DS).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , conejo |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, conejo |
| Anti Músculo Liso Actina ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, ratón |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, conejillo de indias |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, ratón |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, ovejas |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, |
| ratón PNA Lectina | Sigma | L 7381 | |
| Anticuerpos secundarios | Tecnologías | Alexa fluor Sondas moleculares | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher marca super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Suero de becerro fetal | Sigma | 11K413 | |
| Reactivo bloqueador | Invitrogen | Componente del kit TSA #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield medio de montaje | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Casetes Tissue-loc Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Casetes de biopsia | Premiere | BC0109 | Disponible en diferentes colores |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Ácido cítrico | Sigma | C1909-500G | |
| Citrato de sodio tribásico dihidratado | Sigma | S4641-1Kg | |
| Clorhidrato de Trizma | Sigma | T5941-500G | |
| Xileno | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Etanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro cuchillos | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 con recubrimiento cerámico | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtomo | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Microscopio de campo amplio | ||
| Nikon NikonA1Rsi | Nikon | . Configuración: cámara NikonA1 plus, escáner: Galvano, detector: DU4. Óptica Plan Apo lambda 10X. Modalidad: Láser de fluorescencia de campo amplio confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Microscopio de disección de fluorescencia | |
| Zeiss | Zeiss | Microscopio de fluorescencia automatizado | |
| imágenes | |||
Referencias
- Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
