El estudio de la señalización Wnt Durante Patrones de llevar a cabo Airways
Summary
El uso de ratones reportero acoplados a todo el montaje y la sección de tinción, microscopía y ensayos in vivo facilita el análisis de los mecanismos que subyacen en el patrón normal de las vías respiratorias. A continuación se describe cómo estas técnicas contribuyeron al análisis de la señalización de Wnt durante el desarrollo traqueal.
Abstract
Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.
Introduction
El desarrollo del tracto respiratorio es iniciado por día embrionario 9 (E9) con la aparición de células positivas en el Nkx2.1 endodérmico ventral del intestino anterior 1,2. Separación del tubo esofágico-traqueal resolverá por E11.5 cuando los tubos se pueden distinguir como entidades distintas, cada una rodeada por tejido mesenquimal 3. La señalización de Wnt desempeña un papel clave en la especificación de las vías respiratorias como la supresión de Wnt2 y Wnt2b, expresada por el mesénquima esplácnico y supresión de β-catenina del epitelio respiratorio endodérmico resultará en agenesia pulmonar 4,5. Nuestros estudios anteriores determinaron que la supresión de Wls, una mediación de la secreción de receptor de carga de todos los ligandos Wnt, a partir de los resultados de las vías respiratorias endodérmico en hipoplasia pulmonar, defectos en el desarrollo vascular pulmonar y de errores de modelado de la mesénquima traqueal 6,7. Estos datos apoyan la importancia de la cro epitelio-mesenquimalss hablar en la diferenciación celular y la especificación, ya que también se ha demostrado en otros estudios 8,9.
El estudio de las primeras etapas del desarrollo de los pulmones se basa en genética, in vitro e in vivo técnicas ex que han permitido comprender mejor los mecanismos que impulsan la identidad respiratoria 10-16. Cultivos de explantes de pulmón enteros en la interfase aire-líquido se han utilizado ampliamente para estudiar los efectos de los factores de crecimiento en las primeras etapas de la morfogénesis pulmonar 10,17,18 ramificación. Mientras se usa este método como lectura de cambios morfológicos, tales como la morfogénesis de ramificación, y la modulación de la expresión génica, se limita al estudio de las primeras etapas del proceso de desarrollo, ya que la cultura misma no es compatible con el desarrollo de la vasculatura 17. El desarrollo del cartílago traqueal requiere tiempos de incubación más largos que pueden ser incompatibles con esta técnica de cultivo.
para ANALYZe la función de señalización Wnt durante la formación de las vías respiratorias, hemos adaptado técnicas estándar para satisfacer las necesidades de nuestros estudios embrionarias. Hemos modificado volúmenes, tiempos de tinción, ciclo de procesamiento para la inclusión en parafina y el calendario para la limpieza del tejido traqueal-pulmón. El principal objetivo de la optimización de las técnicas descritas en el presente estudio fue analizar las primeras etapas del desarrollo traqueal en ratones que tienen lugar desde E11 a E14.5. Utilizando el reportero ratones línea Axin2LacZ nosotros los sitios precisamente determinadas de la actividad / β-catenina en el mesénquima traqueal en desarrollo. También hemos adaptado procedimiento de tinción de lectina para todo el tejido traqueal montaje. Por lo tanto, hemos sido capaces de visualizar condensaciones mesenquimales y predecir los sitios en donde se llevará a cabo la condrogénesis. La tinción de todo el montaje y las secciones de tejido embrionario obtenido de ratones WlsShhCre, junto con técnicas de microscopía avanzada, nos permitió dar a conocer el papel de los ligandos Wnt producidos por el traepitelio traqueal en el patrón traqueal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Acontecimientos que subyacen a la morfogénesis de las vías respiratorias no se entienden completamente, en particular los procesos necesarios para el modelado de las vías aéreas de conducción. Estudios anteriores han utilizado técnicas ex vivo en el que se cultivan los explantes en desarrollo en la interfase aire-líquido o incrustado en matrigel 21,22. Estos estudios han demostrado que los factores de crecimiento influyen en el patrón de la tráquea y el desarrollo de la formación de cartíl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos la ayuda de Mike y Matt Muntifering Kofron con la imagen confocal y Gail Macke con procedimientos histológicos. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud-NHLBI (K01HL115447 a DS).
Materials
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10x. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
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